隨著發(fā)光(luminescence)技術(shù)在多種生物實(shí)驗(yàn)中的廣泛應(yīng)用，生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)越來(lái)越成為的生物檢測(cè)手段,。在這篇文章中,，我們將詳細(xì)討論生物發(fā)光技術(shù)在生物檢測(cè)中的應(yīng)用，以及它與其它發(fā)光檢測(cè)手段相比所顯示出的優(yōu)點(diǎn),。
1 生物發(fā)光的特點(diǎn)
根據(jù)產(chǎn)生光子的能量來(lái)源不同,，發(fā)光可分為以下四大類，一是熒光(fluorescence)：依靠光子發(fā)光,；二是化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)：依靠化學(xué)能量發(fā)光,；三是輻射發(fā)光：依靠放射性能量發(fā)光；四是電能發(fā)光：依靠電能量發(fā)光,。其中,，生物發(fā)光(bioluminescence)是依靠天然的酶促化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量而發(fā)光，屬于化學(xué)發(fā)光,，它天然地存在于許多生物體內(nèi),，例如螢火蟲、深海里的水母和一些細(xì)菌,。目前,，在生命科學(xué)研究中，應(yīng)用的是熒光和化學(xué)發(fā)光,。而生物發(fā)光作為化學(xué)發(fā)光的重要類別,，也日益受到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。物質(zhì)發(fā)光的機(jī)理是：分子首先受到激發(fā),，吸收能量,，從穩(wěn)定的基態(tài)躍遷到不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，而當(dāng)它從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí),，能量就以光子的形式釋放出來(lái)(圖1),，檢測(cè)發(fā)出的光子就能確定發(fā)光分子的存在,。發(fā)光技術(shù)能否在生物檢測(cè)中得到應(yīng)用及其應(yīng)用的范圍,，在很大程度上取決于激發(fā)分子的能量來(lái)源。因?yàn)榧ぐl(fā)能量的來(lái)源不同,，其產(chǎn)生的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度(信號(hào)對(duì)本底的相對(duì)值)則不同,，對(duì)檢測(cè)器的靈敏度要求也不同。以生物發(fā)光和熒光為例：對(duì)于熒光來(lái)講,，一方面,，由于熒光的光子能量吸收效率高，分子可以釋放大量的光能,，從而產(chǎn)生高強(qiáng)度的光信號(hào),，利于檢測(cè)；另一方面，這種高流量的激發(fā)光子有時(shí)會(huì)嚴(yán)重干擾光感檢測(cè)器發(fā)射光子的分析能力,，同時(shí)也可能激發(fā)生物樣品本身含有的熒光團(tuán),，而產(chǎn)生其它非特異的發(fā)射光，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)本底過(guò)高,。也正是由于熒光的這種特性,，即報(bào)告基團(tuán)中高強(qiáng)度的信號(hào)與高強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)本底共存，使得其檢測(cè)相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的能力大大降低,。對(duì)于生物發(fā)光來(lái)講,，它與熒光形成鮮明對(duì)照，因?yàn)樯锇l(fā)光依靠天然的酶促化學(xué)反應(yīng)發(fā)光,，不需要引進(jìn)外源的光能,，所以應(yīng)用生物發(fā)光作為檢測(cè)手段的報(bào)告基團(tuán)的實(shí)驗(yàn)本底很底。雖然生物發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)度沒(méi)有熒光那么高,，但由于其*的發(fā)光原理,，生物發(fā)光可以比熒光敏感一百甚至一千倍以上。這是生物發(fā)光越來(lái)越成為很多生物研究領(lǐng)域的生物檢測(cè)手段的原因之一,。
在實(shí)際應(yīng)用時(shí),，需要反復(fù)權(quán)衡信號(hào)強(qiáng)度的要求和實(shí)驗(yàn)本底的影響，以選擇*的檢測(cè)技術(shù),。在光子檢測(cè)能力比較低的情況下,，實(shí)驗(yàn)本底很大程度上取決于儀器檢測(cè)的對(duì)象，例如顯微鏡和流式細(xì)胞儀,，由于需要檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞光學(xué)信號(hào)的變化,，對(duì)發(fā)射光信號(hào)的強(qiáng)度要求非常高，因此,，熒光通常會(huì)成為這一類應(yīng)用領(lǐng)域的,。然而，當(dāng)需要檢測(cè)大量的生物樣品的時(shí)候,，對(duì)光子檢測(cè)能力的要求就會(huì)相應(yīng)降低,，對(duì)降低實(shí)驗(yàn)本底的要求相應(yīng)會(huì)增加，比如在檢測(cè)單個(gè)試管樣品,、多孔培養(yǎng)板樣品,，或者對(duì)器官(如老鼠器官)進(jìn)行圖像分析的時(shí)候，生物發(fā)光因其低本底和高靈敏度而倍受歡迎,。而且由于生物發(fā)光檢測(cè)器不需要使用光學(xué)濾片,，從而為縮短樣品和檢測(cè)器之間的距離提供了可能，由此也更加提高了檢測(cè)的效率,。生物發(fā)光的靈敏度可以達(dá)到10-20 mol,，相當(dāng)于6，000多個(gè)螢光素酶分子。對(duì)于一個(gè)有幾百個(gè)細(xì)胞的生物樣品來(lái)說(shuō),，一個(gè)細(xì)胞里只要有幾個(gè)分子的螢光素酶就可以被檢測(cè)到,。而且生物發(fā)光的高靈敏度使得它可以檢測(cè)的濃度范圍非常寬，大多數(shù)可以跨越6～8個(gè)數(shù)量級(jí),，而且現(xiàn)代生物發(fā)光檢測(cè)儀技術(shù)的更新也使得如此大跨度的檢測(cè)成為可能,。另外，由于生物發(fā)光來(lái)源于天然生物體內(nèi)的酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng),，當(dāng)將其引進(jìn)生物樣品內(nèi)的時(shí)候,，對(duì)正常的生物活動(dòng)不會(huì)添加太多負(fù)面影響。而且,，因?yàn)槲灩馑孛傅牡孜镌诜磻?yīng)時(shí)是被包裹在螢光素酶分子的內(nèi)部,，從而可以在zui大限度上保護(hù)正常的酶促發(fā)光反應(yīng)不受外界的干擾。
2 生物發(fā)光作為報(bào)告基因的應(yīng)用及其優(yōu)點(diǎn)
生物發(fā)光在生命科學(xué)研究中zui廣泛的應(yīng)用是作為監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的報(bào)告基因,。其中,，螢火蟲體內(nèi)天然存在的螢光素酶通常是研究人員的。螢火蟲的螢光素酶是一個(gè)61kDa的單體蛋白,，它主要催化作用于名為螢光素(luciferin)的螢光素酶底物,，在有ATP和氧氣存在的條件下產(chǎn)生黃綠色的光(發(fā)射光波長(zhǎng)是560 nm)。
當(dāng)使用報(bào)告基因來(lái)監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄活性的時(shí)候,，研究人員zui大的顧慮是引進(jìn)外源的報(bào)告基因可能會(huì)影響正常的生物活性,，尤其是當(dāng)報(bào)告基因通常需要和生物體內(nèi)自身細(xì)胞的分子活動(dòng)相時(shí)，高濃度的外源基因會(huì)過(guò)分加重生物內(nèi)部細(xì)胞活動(dòng)的負(fù)擔(dān),，從而影響正常的生理活動(dòng),，甚至造成不正常的生理現(xiàn)象。因此,，盡量降低報(bào)告基因的濃度就成為研究成功的關(guān)鍵,。以綠色熒光蛋白為例，它是一類天然存在的發(fā)光蛋白,，由于它能產(chǎn)生高強(qiáng)度的發(fā)射熒光,，所以可以獲得非常清晰、生動(dòng)的顯微圖像,，在單細(xì)胞生物圖像分析中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用,。但因?yàn)榍逦鷪D像的產(chǎn)生通常需要綠色熒光蛋白高濃度表達(dá)，從而加重了生物內(nèi)部細(xì)胞活動(dòng)的負(fù)擔(dān),，使得綠色熒光蛋白不適合作為監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的報(bào)告基因。所以在選擇合適的報(bào)告基因時(shí),，特別是和綠色熒光蛋白相比較之后,，生物發(fā)光由于其低表達(dá)和高靈敏度使其在眾多的選擇中脫穎而出。
監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄活性要求報(bào)告基因能夠快速監(jiān)測(cè)目標(biāo)基因細(xì)微的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的濃度取決于兩大動(dòng)態(tài)過(guò)程：即蛋白合成過(guò)程(受基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控)和蛋白降解過(guò)程,。如果蛋白降解過(guò)程很慢,，則會(huì)使蛋白高度穩(wěn)定，從而會(huì)造成蛋白的本底表達(dá)水平過(guò)高,，那么基因轉(zhuǎn)錄活性改變所產(chǎn)生的新蛋白的合成就不容易被檢測(cè)到,。這樣一來(lái)，報(bào)告基因的表達(dá)就不能準(zhǔn)確地反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄活性的變化,。實(shí)驗(yàn)證明,，在螢光素酶的序列上添加蛋白降解序列，如小鼠鳥氨酸脫羧酶(mouse ornithine decarboxylase,， ODC)中富含脯氨酸- 谷氨酸- 絲氨酸- 蘇氨酸(proline-glutamate-serinethreoninerich,，PEST)的序列，可以顯著地提高檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)答性,，并且不會(huì)對(duì)檢測(cè)手段的靈敏度造成太大影響,。與之相反，由于綠色熒光蛋白的高表達(dá)和高穩(wěn)定性,，使得添加蛋白降解信號(hào)反而在很大程度上限制了檢測(cè)的靈敏度,。
為了進(jìn)一步提高檢測(cè)基因的效率，我們對(duì)螢光素酶基因序列的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化,，使得它在多種哺乳細(xì)胞中的表達(dá)水平提高了5～10倍,；同時(shí)，為了減少對(duì)基因的非特異性調(diào)控,，我們也對(duì)螢光素酶的載體進(jìn)行了優(yōu)化,，去除了載體上哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的保守序列，從而大大降低了實(shí)驗(yàn)的本底,，顯著提高了實(shí)驗(yàn)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度,。優(yōu)化后的螢光素酶報(bào)告基因可以成功地應(yīng)用在各項(xiàng)生物研究領(lǐng)域中，例如對(duì)腫瘤壞死因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究,。腫瘤壞死因子是由單核- 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的能致腫瘤細(xì)胞壞死的活性因子,，能加強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬和消化功能，促進(jìn)其粘附于血管內(nèi)皮和遷移出血管之外,，并能激活轉(zhuǎn)錄因子NF- B調(diào)控的包括IL-1,、GM-CSF在內(nèi)的多種基因的表達(dá)。在外源表達(dá)NF- B螢光素酶報(bào)告基因的HEK293 細(xì)胞中,，腫瘤壞死因子的刺激可以有效地使螢光素酶的表達(dá)提高1000 倍以上,。同樣的檢測(cè)方法也可以成功地檢測(cè)腫瘤壞死因子阻斷劑對(duì)腫瘤壞死因子生物活性的阻斷效率(IC50=0.77 nmol)。
3 生物發(fā)光的其它應(yīng)用
生物發(fā)光的強(qiáng)度取決于酶促化學(xué)反應(yīng)中的各個(gè)反應(yīng)成分的濃度,，包括熒光素酶濃度,、ATP濃度和螢光素酶底物即螢光素的濃度,。通常，在生物發(fā)光的檢測(cè)體系中,，如果保持其它成分的濃度過(guò)量且恒定,，就可以檢測(cè)與生物活性相關(guān)的某個(gè)特定成分的濃度變化。我們上面談到的用螢光素酶作為報(bào)告基因來(lái)監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄活性的實(shí)驗(yàn),，就是把螢光素酶濃度和基因轉(zhuǎn)錄活性直接關(guān)聯(lián)起來(lái),，螢光素酶濃度是我們的zui終監(jiān)測(cè)目標(biāo)。此外,，如果我們固定螢光素酶的濃度并使其過(guò)量,，生物發(fā)光還可以用來(lái)監(jiān)測(cè)與ATP或螢光素濃度相關(guān)的生物學(xué)活性。
通過(guò)檢測(cè)螢光素的濃度來(lái)監(jiān)測(cè)某一生物學(xué)活性的實(shí)驗(yàn)原理是：在螢光素上添加一個(gè)化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行修飾,，建立一個(gè)螢光素酶無(wú)法識(shí)別的"修飾"底物,，而只有通過(guò)特定的生物反應(yīng)切除這個(gè)化學(xué)基團(tuán)，螢光素才能恢復(fù)活性,，酶促反應(yīng)才能發(fā)生,，這樣我們就可以把生物發(fā)光的強(qiáng)度和這個(gè)特定的生物反應(yīng)起來(lái)。Asp-Glu-Val-Asp-6'-aminoluciferin是一個(gè)沒(méi)有活性的螢光素衍生物,，只有當(dāng)半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)存在并切除這個(gè)四肽的序列,，釋放出游離的螢光素時(shí)，螢光素酶酶促反應(yīng)才能發(fā)生,。因?yàn)榘腚装彼?天冬氨酸蛋白酶的活性是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo),，這樣的設(shè)計(jì)使生物發(fā)光成為一個(gè)有效的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的手段。當(dāng)然這一設(shè)計(jì)也可以用于運(yùn)用熒光的細(xì)胞凋亡檢測(cè)上,，即把同樣四肽的序列加到熒光染料Rhodamine110上,。但由于生物發(fā)光*的低表達(dá)和高靈敏度，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,，運(yùn)用生物發(fā)光研究細(xì)胞凋亡,，其敏感性比運(yùn)用熒光技術(shù)高將近一百倍。類似的設(shè)計(jì)也可以用來(lái)利用生物發(fā)光檢測(cè)其它蛋白酶的活性,，比如caspase-8,、caspase-9、二肽基肽酶Ⅵ(DPPIV),、caspase-3,、鈣蛋白酶(calpain)、蛋白酶體(proteosome)等,，并且還可以檢測(cè)其它如CYP450活性,、單氨氧化酶等的酶促反應(yīng)。
生物發(fā)光zui早用于檢測(cè)ATP的濃度,，并且迄今為止仍然是快速檢測(cè)細(xì)胞活力zui廣泛使用的方法之一,。與基于熒光的細(xì)胞活力檢測(cè)方法(如使用tetrazolium)相比,，用生物發(fā)光來(lái)檢測(cè)哺乳細(xì)胞的生物活性,，其敏感度要高達(dá)一百倍以上,，而且只需要5 min。用生物發(fā)光來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的生物活性,，靈敏度非常高,，細(xì)菌個(gè)數(shù)小于10時(shí)，都可以被檢測(cè)到,。用生物發(fā)光檢測(cè)ATP的方法還可用于檢測(cè)消耗ATP的生物酶的濃度,。以激酶為例，由于它可以作用于不同的磷酸鹽受體,，包括蛋白,、脂類和多糖底物，這種方法可以作為一個(gè)通用的檢測(cè)激酶活性的手段,。zui近,，我們利用cAMP對(duì)蛋白激酶A的調(diào)控和蛋白激酶A的激酶反應(yīng)對(duì)ATP的消耗建立了一個(gè)檢測(cè)cAMP濃度變化的生物發(fā)光檢測(cè)方法。具體來(lái)說(shuō),，細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度可調(diào)節(jié)蛋白激酶A 的活性,，而蛋白激酶A被激活后催化相應(yīng)的磷酸化反應(yīng)則需要消耗ATP，這樣一來(lái)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度就會(huì)降低,，因此,，我們檢測(cè)到的ATP的濃度就與蛋白激酶A的活性成反比，也與cAMP的濃度成反比,。由于我們能夠?qū)⑸锇l(fā)光和ATP濃度直接關(guān)聯(lián)起來(lái),，所以我們建立了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)G蛋白-偶聯(lián)受體活性或磷酸去脂酶活性的快速敏感的檢測(cè)方法。
4 結(jié)語(yǔ)
生物發(fā)光在復(fù)雜的生物有機(jī)體研究中具有巨大的潛力和價(jià)值,。無(wú)論是它在很低的濃度下就可以發(fā)出清晰并定量的信號(hào)這一特性,，還是它在哺乳細(xì)胞中低本底的優(yōu)點(diǎn)，都使得生物發(fā)光技術(shù)在揭示生命奧秘的過(guò)程中擁有*的地位,。因此,，生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)必將在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究和新藥開(kāi)發(fā)等諸多領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越強(qiáng)大的作用。
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