蛋白純化過程中常遇見一些問題，這里整理了下幾個(gè)蛋白純化實(shí)驗(yàn)中的遇見的問題及其解決方式,。
1)我現(xiàn)在手頭有個(gè)融合蛋白,，純化的時(shí)候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性,。
請(qǐng)問有哪些可能會(huì)出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測(cè)過基因序列,，沒有問題,。細(xì)胞破碎后，融合蛋白在沉淀里,，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析,，但效率只有50～60%左右,。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會(huì)沉淀,，我用0.5%CHAPS助溶可勉強(qiáng)溶解部分,，目的蛋白疏水性比較強(qiáng)。
既然是疏水性很強(qiáng)你可以加點(diǎn)甘油或者乙二醇降低極性,，這樣溶解就會(huì)好得多,，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時(shí)保護(hù)你的蛋白,，你再做純化就可以了,，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高,，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好,，你失去活性你可以監(jiān)測(cè)一下提取，純化,，酶切到底哪里失去了活性,，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值,，看看改變它對(duì)溶解度有沒有影響,。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點(diǎn)，這也是個(gè)辦法,。
2)請(qǐng)問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?
親和的填料合成過20來種,，你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯(lián)的有限,，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián),，何況它們幾乎是同一個(gè)輔酶，你是不是考慮把FAD連上去,。當(dāng)然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個(gè)仲胺,，可以偶聯(lián)到帶長(zhǎng)手臂的環(huán)氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好,，因此我覺得這個(gè)沒有什么問題,。
此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍(lán)色瓊脂糖凝膠,，因?yàn)樗呐浠慕Y(jié)構(gòu)和FMN的三個(gè)環(huán)很相似,，它能純化不少脫氫酶和激酶,。
我已經(jīng)給你發(fā)了相關(guān)一些偶聯(lián)的材料，請(qǐng)查收,，現(xiàn)在一般要自己合成親和填料,，有很多公司都提供活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以,，其中比較常用的有溴化氰瓊脂糖凝膠,，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠,，羧基瓊脂糖凝膠,，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等,，但是如果是小分子的配基選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好,，此外也曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)固定輔酶時(shí)，偶聯(lián)位置不同,，選擇性有差別,，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對(duì)偶聯(lián)的配基有不同的要求,，所以要對(duì)自己的配基了解比較清楚就可以選擇合適的活化介質(zhì),。
我一般在合成的時(shí)候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應(yīng)用的范圍廣氨基巰基羥基都可以,，而且合成的介質(zhì)剛性好,，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應(yīng)基團(tuán),。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定,，配基脫落少。我覺得是不錯(cuò)的選擇,。
包涵體的蛋白復(fù)性做得不多,，但是我記得有個(gè)哥們說zui管用的辦法也是zui簡(jiǎn)單的方法，他說在復(fù)性的時(shí)候盡量別想什么太高難的技術(shù),，那些時(shí)髦但不一定好用,，常用的有透析復(fù)性，稀釋復(fù)性,，包括國(guó)外的專家也這么說,。我覺得有時(shí)候開始摸不出來未必就是方法不行，關(guān)鍵要經(jīng)常改變條件,。
層析復(fù)性很時(shí)髦,，但是真正能用的不很多，我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同,，所以關(guān)鍵要多看文獻(xiàn),，多琢磨自己蛋白的特性,，多嘗試。
3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時(shí),，鹽濃度太高對(duì)柱效有影響嗎?若有,，一般對(duì)鹽濃度限度如何?
大家別客氣，除鹽對(duì)于濃度應(yīng)該也是有一定的限制的,，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些,，相對(duì)需要的柱子的分辨率也要高點(diǎn)，但是在正常的范圍如1-2M應(yīng)該影響不大,，不過要除得很干凈還是盡量少上點(diǎn)樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大,。
4)我的蛋白17kd左右,，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化,，現(xiàn)在我用聚乙二醇修飾它,，分子量增加5000左右，修飾率不可能達(dá)到100%,，請(qǐng)問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開?(當(dāng)然修飾后還殘留有聚乙二醇,，這個(gè)小分子也要除掉)
他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯(cuò)的做法,，畢竟PEG是鏈狀的分子,，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后,，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試,，它的范圍在1000-30000，應(yīng)該是不錯(cuò)的選擇,。此外PEG是個(gè)疏水性的鏈,，修飾后的蛋白疏水性增強(qiáng)，修飾度越高,，疏水性越強(qiáng),，可以用這個(gè)原理分離。離子交換也可以選擇,，因?yàn)橥瑯拥览?，修飾度越高，電荷被屏蔽也越多,，電荷也越少,，因此?yīng)該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理,，你可以試試,，你手頭的親和能不能分開,，你在這幾個(gè)方法里選擇看哪個(gè)更經(jīng)濟(jì)好用就可以。
5)我是個(gè)新手,，謝謝樓主給我解決了許多難題,。
我有個(gè)問題困繞很久，從細(xì)菌中提取酶,，好象用常規(guī)的方法(超聲波破壁,，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白,。是不是這種蛋白也是疏歲水性較強(qiáng),，需要加助溶劑才能提取出來?另外，我是不是也可以加點(diǎn)甘油或者PEG來提取?
其實(shí)這個(gè)問題我覺得是這樣的,，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清,，你的目標(biāo)蛋白的分子量你是應(yīng)該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里,，剩下的問題你再解決如何提取,。
對(duì)于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取,，我曾經(jīng)提取一個(gè)酶用水就是提取不出來,，需要用鹽才能提取出來，多試試,，設(shè)計(jì)個(gè)方案,，這樣才能解決問題，所以不一定加甘油就管用,，你還得注意破碎本身會(huì)不會(huì)有問題,，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續(xù)探討,。
6)HPLC是用來分析檢測(cè)or分離純化?
如果可以用來純化,，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來分析檢測(cè)，怎樣指導(dǎo)以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備,，純化上樣量小,，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì),，同時(shí)配合質(zhì)譜等就何以得到很多單一蛋白的特性包括序列等,，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好,，定量準(zhǔn)確,，所以也可以用于定量和定性，是分析中*的工具。
分析出來后如果這個(gè)物質(zhì)很穩(wěn)定,，直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備,，因此摸好了分析的條件也就相應(yīng)有了制備的條件。
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