液相色譜柱安裝與使用說明
HPLC分析是系統(tǒng)的工作，每個環(huán)節(jié)都很重要,；看似簡單的環(huán)節(jié),，反而容易疏忽，引起整個實驗的結(jié)果偏差，因此養(yǎng)成良好的習(xí)慣是很重要的,。色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟,，液相色譜柱的正確安裝與使用，是色譜工作的關(guān)鍵,；也是獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路,。
使用儀器: LC-600液相色譜儀
一·液相色譜柱的安裝
1 液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
a．空柱由柱接頭柱管及濾片組裝而成
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件,，一端是為7/16英才外螺紋,，另一端是3/16英才的內(nèi)螺紋（國內(nèi)外已規(guī)范化）。7/16英才外螺紋與1/4英寸柱管（￠6.35mm）連接,，中間放置壓環(huán)用于密封,。3/16英才的內(nèi)螺紋與1/16英才（￠1.57mm）的連接管連接，之間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封,。為了盡量減少柱外死體積,，在安裝色譜柱時，用￠1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底,，然后在擰緊空心螺釘,。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上（連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2.5mm長或其他固定尺寸。
在兩端柱接頭內(nèi),，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或濾網(wǎng)）,，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì),，能耐受一般的溶劑作用。但含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,，故使用時要注意,，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕,。
b． 柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料和流動相之間進(jìn)行的，柱子的分類是根據(jù)填料類型而定,。
正相柱：多以硅膠為填料,。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10um的范圍內(nèi),。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN,，—NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì),，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)（ODS）的非極性填料,。也有無定型和球型之分。常用的其他反相填料還有鍵合C8，C4,，C2,，苯基等，其顆粒直徑在3-10um之間,。
2 色譜柱的安裝
a． 拆開柱包裝盒,，確認(rèn)色譜柱的類型，尺寸,，出廠日期以及柱內(nèi)儲存的溶劑,。
b． 擰下柱兩端的密封堵頭放回包裝盒備用。
c． 按柱管上標(biāo)示的流動相流向,，將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口連接（如條件允許,，建議在柱前使用保護(hù)柱）；柱的出口與檢測器連接,。連接管是外徑為.57mm,、內(nèi)徑為0.1mm-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán),。在接管時一定要設(shè)法降低柱外死體積,。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底,，然后順時針擰緊空心螺釘,，直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰1/4-1/2圈,，切記不要用力太大,。如色譜柱通過流動相加壓后有漏夜現(xiàn)象，請用扳手順時針擰1/4圈,，直至不漏夜為止,。
二·液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前，進(jìn)行的柱的性能測試,，并將結(jié)果保存起來,，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品,、流動相,、柱溫等條件的差異而有所不同；另外做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進(jìn)行（出廠測試所使用的條件是*條件）,，只要這樣測試的結(jié)果才有可比性,。
1 樣品的前處理：
a． 使用流動相溶解樣品。
b． 使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì),。
c． 使用0.45um的過濾膜除去微粒雜質(zhì),。
2 流動相的配置：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,，因此要求流動相具備以下的特點：
a． 流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）,。
b． 流動相具有一定的惰性,，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。
c． 流動相的黏度要盡量的小,，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果,；同時降低柱壓降，延長液壓泵的使用壽命（可運行提高溫度的方法降低流動相的黏度）,。
d． 流動相的化學(xué)性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng),。如用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制,。
e． 流動相的沸點不要太低,，負(fù)責(zé)容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進(jìn)行,。
f． 在流動相配置好后,，一定進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用,。
3 流動相流速的選擇：
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對于一根特定的色譜柱,，要追求*柱效，使用*流速,。對內(nèi)徑為4.6 mm的色譜柱,，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱,，流速0.8ml/min為佳,。
當(dāng)選用*流速時，分析時間可能延長,?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）,。
注意：
1）.由于甲醇的廉價,，對于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的除外）。
2）.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的乙烷做流動相,，沒有提純的乙烷不的使用。用水使用超純水（電阻率大于18兆歐）,，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì),，有可能影響分析的結(jié)果。
3）.含水流動相在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜,。加入*,，防止細(xì)菌的生長。
4）.流動相要求使用0.45um濾膜過濾,，除去微粒雜質(zhì),。
5）.使用HPLC級溶劑配置流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,，提高柱性能,。
4 柱性能的測試：
——啟動液相色譜儀：a.流動相流速設(shè)定為1ml/min。
b．UV檢測器波長設(shè)定為254nm,。
——使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品,。
——記錄并計算測試結(jié)果。
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