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那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下三種紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量,。

1. 280nm的光吸收法
因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有**大吸收,，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大,，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是**常用的紫外吸收法。
測(cè)定時(shí),，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中,，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280,。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1～1.0mg/ml左右,。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí),，a280約為1.0左右,。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。
許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值（A1％1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查,，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度,。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1％1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系,。文獻(xiàn)值A(chǔ)1％1cm,，稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。
蛋白質(zhì)濃度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%濃度  10mg/ml)
例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 ：   A1％1cm=22.8 (280nm)
若查不到待測(cè)蛋白質(zhì)的A1％1cm值,，則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml,。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）,。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取6支試管，按下表編號(hào)并加入試劑：
管號(hào) 1 2 3 4 5 6
BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
A280
用第1管為空白對(duì)照,，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度A280,，以A280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作圖,，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線,，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量,，也可以用2至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的A1％1cm,，280nm
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克）,，但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng),，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍,，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值,。通常：
純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260  = 1.8
純核酸的光吸收比值： A280/A260 = 0.5
含有核酸的蛋白質(zhì)溶液,，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值,，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式,，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260
此經(jīng)驗(yàn)公式是通過(guò)一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)建立的,。
3. 215nm與225nm的吸收差法
蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定時(shí),，可用215nm與225nm吸收值之差，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度,。
用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測(cè)定215nm和225nm的吸光度值,，并計(jì)算出吸收差：
吸收差d= A215 －A225
以吸收差d為縱座標(biāo),，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再測(cè)出未知樣品的吸收差,，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于三種紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量,。
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