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技術(shù)專題:凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)

閱讀:2956      發(fā)布時間:2019-3-1
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(一)原理
凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)(鹽析得到的IgG)中均含有硫酸銨等鹽類,,這類將影響以后的純化,,所以純化前均應(yīng)除去,此過程稱為“脫鹽”(desalthing),。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法,,這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點是透析后析品終體積較小,,但所需時間較長,,且鹽不易除盡;凝膠過濾法則能將鹽除盡,,所需時間也短,,但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以,,要根據(jù)具體情況選擇使用,。前實驗中樣品體積較小,凝膠達濾后樣品體積不會太增加,,所以選用凝膠過濾法,。

(二)試劑與器材
(1)Sephadex G-25。
(2)0.0175mol/L,,pH6.7磷酸鹽緩沖液,。
(3)奈氏(Nessler)試劑:于500ml錐形瓶內(nèi)加入碘化鉀150g,碘110g,,汞150g及蒸餾水100ml,。用力振蕩7~15min,至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時,,混合液溫度升高,,將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩,直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的碘化鉀汞液為止,。將上清液傾入2000ml量筒內(nèi),,加蒸餾水至2000ml,混勻備用,。
(4)20%(W/V)磺基水楊酸溶液,。
(5)1.5cm×20cm層析柱。
(6)黑,、白比色磁盤,。

(三)操作
(1)取層析柱1支(1.5cm×20cm),,垂直固定在支架上,關(guān)閉下端出口,。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去,,加入2倍體積的0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液,,并攪拌成懸浮液,,然后灌注入柱,打開柱的下端出口,,繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25,,使凝膠自然沉降高度到17cm左右,關(guān)閉出口,。待凝膠柱形成后,,在洗脫瓶中加入0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱,,以平衡凝膠,。
(2)凝膠平衡后,用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液,,將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面,,打開柱下口,控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi),。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L,,pH6.7磷酸鹽緩沖液,并用此緩沖液洗脫,,控制流速為0.5ml/min左右,。用試管收集洗脫液,每管10滴,。
(3)在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出,。為此,由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中,,加入1滴20%磺基水楊酸,,若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn),直到檢查不出白色沉淀時,,停止收集洗脫液,。
(4)由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中,取1滴溶液,,放置在白色比色盤孔中,,加入1滴奈氏試劑,若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨,。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液,,即為“脫鹽”后的IgG,。

注意:在檢測時,用皮頭滴管吸取管中溶液后應(yīng)及時洗凈,,再吸取下一管,以免造成相互污染假象,。

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