（一）原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制,，因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)”和“不連續(xù)系統(tǒng)”兩種電泳系統(tǒng),。“不連續(xù)系統(tǒng)”大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng),；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分,、pH也不相同,。在實(shí)驗(yàn)中,，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱(chēng)為濃縮膠或成層膠,，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl,，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠,，稱(chēng)為分離膠或電泳膠,，成膠的緩沖液是Tris-HCl，pH8.9,。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸,，pH8.3,?？梢?jiàn),，凝膠濃度、成膠成分,、pH與電泳液緩沖系統(tǒng)各不相同，形成了一個(gè)不連續(xù)系統(tǒng),。
電泳時(shí),，蛋白質(zhì)樣品放置在濃縮膠上,，為防止蛋白質(zhì)樣品在電極緩沖液中擴(kuò)散,，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合,，以提高密度；為觀察蛋白質(zhì)樣品泳動(dòng)的情況,，樣品中還加入溴酚藍(lán)等示蹤染料,，這些有色物質(zhì)的分子比任何一種大分子物質(zhì)泳動(dòng)的速度都快，只要染料未泳動(dòng)出凝膠管,，樣品就沒(méi)有走出膠管的危險(xiǎn),。
在不連續(xù)系統(tǒng)中，當(dāng)接通電源開(kāi)始電泳時(shí),，系統(tǒng)中的甘氨酸,、蛋白質(zhì)、HCl中的氯離子和溴酚藍(lán)等均解離為陰離子,，形成離子流向陽(yáng)極泳動(dòng),。其遷移率取決于離子的電荷數(shù)、分子量大小及形狀,。然而，當(dāng)電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進(jìn)入濃縮膠時(shí),，它們遇到了比pH8.3低的pH（6.7）,，pH下降了近兩個(gè)單位，幾乎接近于甘氨酸的等電點(diǎn)（5.97）,，于是甘氨酸的解離度突然降低,，所帶電荷量明顯減少，遷移率減慢,。血清樣品中個(gè)蛋白質(zhì)成分也進(jìn)入濃縮膠,，pH的改變雖對(duì)其解離度有影響，但比對(duì)甘氨酸要小得多,，其遷移率比甘氨酸要大,，而且濃縮膠的膠孔較大對(duì)蛋白質(zhì)分子不會(huì)造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離,，分子量很小,，摩擦力不大,，其遷移率比蛋白質(zhì)、溴酚藍(lán)都快,。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質(zhì)<溴酚藍(lán)
甘氨酸分子進(jìn)入濃縮膠后解離度的下降,，造成移動(dòng)離子流的突然缺失，出現(xiàn)電流減小電導(dǎo)率下降,。然而,，整個(gè)電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變，根據(jù)電導(dǎo)及電位梯度成反比（E=I/n,，E為電位梯度,，I為電流強(qiáng)度，n為電導(dǎo)率）的關(guān)系,，于是在前導(dǎo)離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度,。處在這個(gè)局部高電位梯度區(qū)域中的血清蛋白質(zhì)各成分，在高電場(chǎng)作用下迅速以不同的速度（分子量不同,、帶電量不同）泳向前導(dǎo)Cl-離子區(qū)域,。當(dāng)?shù)竭_(dá)前導(dǎo)Cl-區(qū)域時(shí)因不缺少離子，大的電場(chǎng)強(qiáng)度減弱,，離子移動(dòng)速度急速減慢下來(lái),，其結(jié)果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過(guò)這個(gè)過(guò)程,，是蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍,，且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層。
當(dāng)離子流繼續(xù)向前,，進(jìn)入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時(shí),，蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢,，同時(shí)在pH8.9條件下,，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加,，消除了離子流缺失的現(xiàn)象,，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì)。凝膠各部分恢復(fù)具有恒定的電場(chǎng)強(qiáng)度,，蛋白質(zhì)的分離*按一般區(qū)帶點(diǎn)用方式進(jìn)行,。
由以上的原理可見(jiàn)，聚丙烯酰胺凝膠的不連續(xù)電泳主要的優(yōu)點(diǎn)就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后,，形成緊密地壓縮層進(jìn)入分離膠,。蛋白質(zhì)各成分預(yù)先分開(kāi)且壓縮成層，可以減少在電泳時(shí)，成分間由于自由擴(kuò)散而造成的區(qū)帶相互重疊所帶來(lái)的干擾,，這樣就提高了電泳的分辨能力,。由于這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，少量的蛋白質(zhì)樣品（1-100??g）也能分離得很好,，分辨率高使血清蛋白質(zhì)可獲得近20多個(gè)區(qū)帶,。
（二）試劑和器材
1．測(cè)試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG,、純化后的IgG,。
2．試劑
（1）制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑
① 凝膠緩沖液：稱(chēng)取1mol/L HCl 48ml,，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g,，TEMED（N，N,，N`,，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解,，調(diào)pH8.9,，然后加重蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶,，4℃貯存,。
② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲(chǔ)液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g,，加重蒸水使其溶解后定容至100ml,。過(guò)濾后置棕色試劑瓶中，4℃ 貯存,，一般可放置1個(gè)月左右,。
③ 分析純過(guò)硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶,，4℃儲(chǔ)存僅能用一周,，好當(dāng)天配制。上述3種試劑用于制備分離膠,。
④ 濃縮膠緩沖液：稱(chēng)取1mol/L HCl 48ml,，Tris5.98g,，TEMED 0.46ml,，加重蒸水至80ml,調(diào)pH6.7，用重蒸水定容至100ml,，置棕色瓶?jī)?nèi),，4℃貯存。
⑤ 濃縮膠貯液：稱(chēng)Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml,，過(guò)濾后置棕色瓶?jī)?nèi),，4℃貯存。
⑥ 40%蔗糖溶液（W/V）
⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg,，加重蒸餾水溶解,，定容至100ml，置棕色試劑瓶?jī)?nèi),，4℃貯存,。
（2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液
稱(chēng)Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml,，調(diào)pH8.3后,，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中,，4℃貯存,，臨用前稀釋10倍。
（3）0．1%溴酚藍(lán)指示劑
（4）染色液 染色液種類(lèi)較多,，染色方法也不*相同,。本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250染色液中，含20%磺基水楊酸,，其優(yōu)點(diǎn)是染色,、固定同時(shí)進(jìn)行，背景易脫色,。0.5%考馬斯亮藍(lán)R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍(lán)0.05g,，磺基水楊酸20g，加蒸餾水至100ml,，過(guò)濾后置試劑瓶?jī)?nèi)保存,。
（5）脫色液 7%乙酸溶液
（6）保存液 甘油10ml，冰乙酸7ml,，加蒸餾水至100ml,。
（7）1%瓊脂（糖）溶液 瓊脂（糖）1g，加已稀釋10倍的電極緩沖液,，加熱溶解,，4℃貯存，備用,。
3．器材 電泳儀 夾心式垂直板電泳槽,。
（三）操作方法
1．安裝夾心式垂直板電泳槽
夾心式垂直板電泳槽操作簡(jiǎn)單，不易滲漏,。這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽,，兩個(gè)電極槽中間夾有一個(gè)凝膠模,，該模由一個(gè)上框形凝膠框、長(zhǎng)與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成,。電泳槽由上儲(chǔ)槽（白金電極在上或面對(duì)短玻璃板）,，下儲(chǔ)槽（白金電極在下或面對(duì)長(zhǎng)玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個(gè)電極槽與凝膠模間靠?jī)?chǔ)液槽螺絲固定,。各部間依下列順序組裝：
（1）將上儲(chǔ)槽和固定螺絲銷(xiāo)釘,，仰放在桌面上。
（2）將上,、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中,。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。
（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲(chǔ)槽上,，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上儲(chǔ)槽,。
（4）將下儲(chǔ)槽的銷(xiāo)孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷(xiāo)釘?shù)纳蟽?chǔ)槽 ，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽 ,。
（5）豎直電泳槽,，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂（糖）,。其目的是封住空隙,，凝固后的瓊脂（糖）中應(yīng)避免有氣泡。
2．配膠
① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中,，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml,，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml,，充分混勻,，抽氣10min，后加AP 10 ml,。
② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合,。
3．制備凝膠板
不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應(yīng)分2步進(jìn)行,。
① 分離膠的制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,，選擇終丙烯酰胺的濃度，本實(shí)驗(yàn)需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液,，其加膠方式不同于連續(xù)系統(tǒng),。混合后的凝膠溶液,，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng),、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm,。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣,，使膠面平整。為防止?jié)B漏,，在上,、下儲(chǔ)槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠*聚合,，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線,。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面,。如需預(yù)電泳,，則上、下儲(chǔ)槽的蒸餾水倒去,，換上分離膠緩沖液,，10mA電流電泳1h，終止電泳后,，棄去分離膠緩沖液,，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數(shù)次，即可制備濃縮膠,。
② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA,，混合均勻后用細(xì)長(zhǎng)的滴管將凝膠溶液加到長(zhǎng)、短玻璃板的窄縫內(nèi)（即分離膠上方）,，距短玻璃板上緣0.5cm處,，輕輕加入樣品槽模板。在上,、下儲(chǔ)槽中加入蒸餾水,，但不能超過(guò)短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處,，用日光燈或太陽(yáng)照射,，進(jìn)行光聚合，但不要造成大的生溫,。在正常情況下,，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色,，表明聚合作用開(kāi)始,。繼續(xù)光照30min，使凝膠聚合*,。光聚和完成后放置30-60min,，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體,，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液,。使液面沒(méi)過(guò)玻璃板約0.5cm,，即可加樣。
4．加樣
作為分析用的PAGE加樣量?jī)H需幾微克,，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶,。為防止樣品擴(kuò)散，應(yīng)在樣品中加入等體積40%蔗糖（內(nèi)含少許溴酚蘭）,。用微量注射器取5ul上述混合液,，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部,，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品,，即可開(kāi)始電泳。
5．電泳
將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接,，負(fù)極與上槽連接（方向切勿接錯(cuò)）,。接通冷卻水，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān),，開(kāi)始時(shí)將電流調(diào)至10 mA ,。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)將電流調(diào)至20-30mA。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時(shí),，將電流調(diào)回到零,，關(guān)電源及冷卻水。分別收集上,、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中,，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲,，取出硅橡膠框,，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開(kāi)移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記,，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色,。
6．固定，染色
本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250（內(nèi)含20%磺基水楊酸）染色液,，染色與固定同時(shí)進(jìn)行,，使染色液沒(méi)過(guò)膠板，染色30min左右,。
7．脫色
用7%乙酸侵泡漂洗數(shù)次,，直至背景藍(lán)色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床,，則可縮短褪色時(shí)間,。脫色液經(jīng)活性碳脫色后，可反復(fù)使用,。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
17
立即詢(xún)價(jià)
您提交后,，專(zhuān)屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)