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瓊脂糖凝膠電泳的原理及實(shí)驗(yàn)過程

閱讀:4000      發(fā)布時(shí)間:2019-2-25
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實(shí)驗(yàn)原理
    瓊脂糖凝膠電泳常用于分離,、鑒定 DNA,、RNA 分子混合物,以瓊脂凝膠作為支持物,,利用 DNA 分子在電場(chǎng)中時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng),,達(dá)到分離混合物的目的,。DNA 分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電,,在電場(chǎng)中由陰極向陽極運(yùn)動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下,,忽略DNA分子攜帶的電荷,,DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng),即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素,。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子量成反比,。
    不同構(gòu)型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環(huán)形 DNA 分子樣品,,其中有三種構(gòu)型的分子:超螺旋分子(cccDNA),、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA),。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNA>IDNA>ocDNA,。
    核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì),。瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子;聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺(Acr)在 N,N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)的催化下聚合形成長(zhǎng)鏈,,并通過交聯(lián)劑 N,N′-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)交叉連接而成,。瓊脂糖凝膠適合分離200bp至近50kb的DNA片段,而聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于小片段(5bp-500bp)的分離效果很好,,且分辯力*,。選擇不同濃度的凝膠,可以分離丌同大小范圍的 DNA 分子,。電場(chǎng)強(qiáng)度愈大,,帶電顆粒的運(yùn)動(dòng)赹快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小,,所以電泳時(shí)一般采用低電壓,,不超過 6V/cm。而對(duì)于大片段電泳,,可以選擇 0.5-1.0V/cm 電泳過夜,。如果選擇高電壓電泳,可使用聚丙烯酰胺凝膠,。
    核酸電泳常采用 TAE,、TBE、TPE 三種緩沖系統(tǒng),。TAE 價(jià)格低廉,,但緩沖能力低。TPE 在進(jìn)行 DNA 回收時(shí),,會(huì)使 DNA 污染磷酸鹽,,影響后續(xù)反應(yīng)。所以綜合考慮,,多采用 TBE 緩沖液,。
    核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(EB)。溴化乙錠是一種扁平分子,,可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間,。在紫外線照射 BE-DNA 復(fù)合物時(shí),通過發(fā)光指示核酸的位置,。由于EB有較強(qiáng)的揮發(fā)性和毒性,,現(xiàn)在大多選擇EB替代品進(jìn)行試驗(yàn),比較常用的有g(shù)elred,,goldview,,ybr-green等,但是整體效果都若于傳統(tǒng)的EB。
材料,、試劑及器具
1,、材料
合適的Marker(分子量標(biāo)準(zhǔn));DNA 樣品
2,、試劑
加樣緩沖液(6x或10x),;瓊脂糖;溴化乙錠(EB),。
3,、器具
(1)電泳系統(tǒng):電泳儀、水平電泳槽,、制膠板等,。
(2)凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀。
實(shí)驗(yàn)過程
1,、按所分離的 DNA 分子的大小范圍,,選擇合適的比例的凝膠,稱取適量的瓊脂粉,,放到一錐形瓶中,,加入適量的 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至瓊脂粉*溶化,,溶液透明,。稍搖勻,得膠液,。待膠液卻至 60℃左右,,在膠液內(nèi)加入適量的比例的溴化乙錠液。
2,、水平放置膠槽,,在一端插好梳子,在槽內(nèi)緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液,,使之形成均勻水平的膠面,。
3、待膠凝固后,,小心拔起梳子,,使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。
4,、在槽內(nèi)加入TBE電泳緩沖液,至液面覆蓋過膠面,。
5,、把待檢樣品,按合適比例與加樣緩沖液混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中,。
6,、接通電泳儀和電泳槽,并接通電源,,調(diào)節(jié)合適電壓,,穩(wěn)壓輸出,開始電泳,。
7,、觀察溴酚蘭的帶(藍(lán)色)的位置。當(dāng)其移動(dòng)至約凝膠長(zhǎng)2/3處時(shí),,可停止電泳,。
8、在紫外透視儀的樣品臺(tái)上重新鋪上一張保鮮膜,,趕去氣泡平鋪,,然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門,,打開紫外燈(360nm 或 254nm),,通過觀察孔進(jìn)行觀察。
注意事項(xiàng)
1,、電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性,、強(qiáng)致癌性物質(zhì),務(wù)必小心,,勿沾染于衣物,、
皮膚、眼睛,、口鼻等,。所有操作均只能在專門電泳區(qū)域操作,戴一次性手套,,并及時(shí)更換,。
2、預(yù)先加入EB 時(shí)可能使 DNA 的運(yùn)動(dòng)速度下降15%左右,,且不同構(gòu)型的 DNA 的影響程度不同,。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,,若凝膠放置一段時(shí)間后才觀察,,即使原來膠內(nèi)或樣品已加 EB,建議選擇EB溶液浸泡染色,。
3,、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡,,需在凝膠液未凝固之前及時(shí)**,否則,,需重新制膠,。
4、電泳時(shí)溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)速度可以用于參考電泳速度,,已實(shí)際電泳條帶運(yùn)動(dòng)速度為準(zhǔn),。
常見問題分析
 

常見問題

原因

對(duì)策

DNA條帶模糊

DNA降解

實(shí)驗(yàn)過程避免核酸酶污染

電泳緩沖液陳舊

電泳緩沖液多次使用后,離子強(qiáng)度降低,,PH值上升,,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果,。TBE建議使用10次就更換緩沖液

所用電泳條件不合適

電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過6V/CM,,溫度<30℃,巨大DNA鏈電泳,,溫度應(yīng)<15℃,,核查所用電泳緩沖液的緩沖能力,注意經(jīng)常更換

DNA上樣量過多

減少凝膠中DNA上樣量

DNA含鹽過高

電泳前通過乙醇沉淀去除多余鹽分

有蛋白污染

電泳前酚抽提去除蛋白

DNA變性

電泳前勿加熱,,用TE緩沖液稀釋DNA

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往PCR體系需要優(yōu)化,PCR程序需要摸索,。

其對(duì)策有:調(diào)整PCR體系和PCR程序,,摸索出合適的條件。

不規(guī)則DNA帶遷移

電泳條件不合適

電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過6V/CM,,溫度<30℃,,巨大DNA鏈電泳,溫度應(yīng)<15℃,,核查所用電泳緩沖液的緩沖能力,,注意經(jīng)常更換

DNA變性

電泳前勿加熱,用TE緩沖液稀釋DNA

帶弱或無DNA帶

DNA上樣量不夠

增加DNA上樣量,,聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高,,上樣量可適當(dāng)降低

DNA降解

實(shí)驗(yàn)過程避免核酸酶污染

DNA跑出凝膠

縮短電泳時(shí)間,降低電壓,,增強(qiáng)凝膠濃度

EB染色的DNA,,所用光源不合適

應(yīng)用短波長(zhǎng)(254nm)的紫外光源

DNA帶缺失

DNA跑出凝膠

縮短電泳時(shí)間,降低電壓,,增強(qiáng)凝膠濃度

分子大小相近的DNA帶不易分辨

增加電泳時(shí)間,,核準(zhǔn)正確凝膠濃度

DNA變性

電泳前勿加熱,用20mM Nacl 緩沖液稀釋DNA

DNA鏈巨大,,常規(guī)凝膠電泳不合適

在脈沖凝膠電泳上分析

電泳時(shí)Ladder扭曲

配膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時(shí)配置

同時(shí)配置,,電泳緩沖液高出液面1-2mm即可

電泳時(shí)電壓過高

電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過6V/CM

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