一、 流動相溶劑的選擇
1.所選用的流動相溶劑要有一定的化學穩(wěn)定性,,不與固定相和樣品組分起反應,,其純度和化學特性必須滿足色譜過程的穩(wěn)定性和重復性的要求。
2.溶劑應當不干擾檢測器的工作,,溶劑應與檢測器匹配,,選擇不影響檢測器正常工作應選擇在測定波長范圍內(nèi)無吸收的流動相。
3.在制備分離中, 溶劑應當易于除去, 不干擾對分離組分的回收,。
4.溶劑的粘度要小,,保證合適的柱壓降。
5.從實用角度考慮,,溶劑應當價格低廉,,容易購得,使用安全,,純度要高,。
二、流動相溶劑使用的注意事項
1.流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑,。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾,、脫氣,清除微粒和灰塵,。 在送液泵內(nèi),,為了防止雜物(固體)進入流路,裝有吸濾器,,但網(wǎng)孔徑為10μm,,比此更小的顆粒仍然可通過,這會導致流路和柱子堵塞和污染,。為此,,建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經(jīng)脫氣,如不脫氣,,在溶劑混合時,,或壓力溫度變化時容易產(chǎn)生大量氣泡,會導致泵誤動作和輸液不暢,,檢測器產(chǎn)生噪聲信號等。
2.流動相恢復到室溫后使用,。流動相溫度與室溫相差時,,流動相在恢復到室溫前,基線水平很難穩(wěn)定,,特別是發(fā)生漂移,,也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機溶劑混合時,,混合液變化大,,往往會與室溫相差很大,務必注意,。
3.做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的,、水應用二次蒸餾水,水相流動相需經(jīng)常更換,,防止長菌變質(zhì),。使用去離子水、針劑水,、純凈水(炊用)并不合適,、尤其是做梯度洗脫時,水中的不純物會成為鬼峰,,從而干擾分析結(jié)果,。
4.流動相的pH值過高或過低,流動相使用純水,,使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液,,使用離子對試劑等,均可能造成色譜柱填料被化學破壞,,這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的
5.用緩沖鹽做流動相時,,在使用前和使用后都要用水清洗流路,禁止將緩沖溶液留在流路中靜置或更長時間,。
6.若需要使用含鹽的流動相,,使用前請過濾。并且使用該含鹽流動相前,,色譜柱需先用低比例有機相(有機相含量應不低于10%)的溶液沖洗,,以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液,建議現(xiàn)用現(xiàn)配,,以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染,。
7.進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性,避免因流動相不互溶而導致的緩沖鹽析出問題,。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時,,用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲存流動相后在接柱子。
8.在更換兩種互不相溶的流動相時,,中間要用異丙醇溶液清洗過渡,。例如:先用甲醇水做流動相,然后在用正己烷做流動相時,,一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水,,然后用正己烷沖洗異丙醇,反之也是一樣,。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換,。
9.儀器在短期(兩三天)不用時,流路中可以是甲醇或水,。儀器在長期不用時,,流路中應用甲醇。
10.對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時,,要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑,,如甲醇、乙腈等,。
11.當流動相溶劑為乙腈時,,流速為1ml/min泵的正常壓力5~7Mpa之間,如果壓力逐漸降低,,基線也出現(xiàn)異常,。這是由于乙氰的粘性大,導致泵的流速降低,??蛇m當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。
12.流動相含有濃硫酸,、濃硝酸,、二氯乙酸、二氯甲烷,、丙酮,、四氯呋南、二甲化砜等溶劑,,會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差,、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺,。流動相含有鹵素離子的溶劑,如KCI,、NaCI,、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用,,以上的溶劑須盡量避免使用,。非用不可時,分析完了后,,應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈,。
13.用于檢定梯度等性能時,短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的,。
14.注意:稀硝酸與甲醇不能混合,否則有可能會引起爆炸,。
三,、液相色譜流動相的貯存
流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi),,不能貯存在塑料容器中,。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑,,導致溶劑受污染,。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng),可能造成柱效降低,。貯存容器一定要蓋嚴,,防止溶劑揮發(fā)引起組成變化,也防止氧和二氧化碳溶入流動相,。
磷酸鹽,、乙酸鹽緩沖液很易長霉,應盡量新鮮配制使用,,不要貯存,。如確需貯存,可在冰箱內(nèi)冷藏,,并在3天內(nèi)使用,,用前應重新濾過。容器應定期清洗,,特別是盛水,、緩沖液和混合溶液的瓶子,以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物,。因甲醇有防腐作用,,所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象,。
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