本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）水平,。向預(yù)先包被了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR），溫育,；溫育后,，加入生物素標(biāo)記的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）抗體。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,，形成免疫復(fù)合物,，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶,，然后加入底物A,、B，產(chǎn)生藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色,。顏色的深淺與樣品中大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（EPCR）的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說明書	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1個	1個
酶標(biāo)包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品40μg/L	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
鏈霉親和素-HRP	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
生物素標(biāo)記的抗EPCR抗體	0.5ml×1瓶	1 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×20倍）×1瓶	（20ml×30倍）×1瓶	2-8℃保存

需要而未提供的試劑和器材

37℃恒溫箱,。
標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀,。
精密移液器及一次性吸頭
蒸餾水，
一次性試管
吸水紙

注意事項

從2-8℃取出的試劑盒,，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘,。酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗誤差
嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜,。
不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用,。
底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標(biāo)本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

操作程序

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋,。)

20μg/L	5號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
10μg/L	4號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
5μg/L	3號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.5μg/L	2號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1.25μg/L	1號標(biāo)準(zhǔn)品	120μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
加樣：1）空白孔,，空白對照孔不加樣品,，生物素標(biāo)記的抗EPCR抗體，鏈霉親和素-HRP,，只加顯色劑A&B和終止液,，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul,，鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體,，故不加)；3）待測樣品孔：加入樣本40ul,，然后各加入抗EPCR抗體10ul,、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜,，輕輕震蕩混勻,，37℃溫育60分鐘。
配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用,。
洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。
顯色：每孔先加入顯色劑A50ul,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.
終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度,。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。