小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測

        試劑盒使用說明書          AE90301Mu

使用前仔細閱讀本說明書,。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術(shù)原理,，來檢測小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）,，只能用于研究用途,，不得用于醫(yī)學診斷,。

用    途：用于小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中腫瘤壞死因子α（TNF-α）測定,。

工作原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平,。向預先包被了小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）單克隆抗體的酶標孔中加入小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α），溫育,；溫育后,，加入生物素標記的抗TNF-α抗體。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,，形成免疫復合物,，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶,，然后加入底物A,、B，產(chǎn)生藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺與樣品中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成 

需要而未提供的試劑和器材

• 37℃恒溫箱,。
• 標準規(guī)格酶標儀,。
• 精密移液器及一次性吸頭
• 蒸餾水，
• 一次性試管
• 吸水紙

注意事項

• 從2-8℃取出的試劑盒,，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘,。酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
• 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差
• 嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
• 為避免交叉污染,，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
• 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用。
• 底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下,。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標本要求 

1．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融。

操作程序

• 標準品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標準品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋,。)

• 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復孔的盡量做復孔。
• 加樣：1）空白孔,，空白對照孔不加樣品,，生物素標記的抗TNF-α抗體，鏈霉親和素-HRP,，只加顯色劑A&B和終止液,，其余各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50ul,，鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體,，故不加)；3）代測樣品孔：加入樣本40ul,，然后各加入抗TNF-α抗體10ul,、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜,，輕輕震蕩混勻,，37℃溫育60分鐘。
• 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用,。
• 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。
• 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘. 
• 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
• 測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。
• 根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度,。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。

操作程序總結(jié)：

檢測范圍：20ng/L→480 ng/L,。

保存：2-8℃,。

有效期：6個月(2-8℃)。