影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性,、檢驗標本中含酶標記物的干擾物,，操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,，從而提高檢測的特異性,，并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果,。
【關(guān)鍵詞】     ELISA     非特異性     顯色
酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）自1971年自問世以來，以其敏感性高,，特異性強,，操作簡便、安全,，而廣泛應用于臨床診斷,，開創(chuàng)了免疫學診斷的新紀元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究,、生產(chǎn)及使用中常常會碰到非特異性問題,，本文就在實驗過程中產(chǎn)生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特異性顯色作一分析,。
1,、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇,。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種,，以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能,，孔底透明度高,，空白值低，各板之間,、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此,，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證，評估,。
1,、2包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度，提高特異性,。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。
1、3包被抗體的效價,。具有高親和力和高特異性的包被抗體,，是決定試劑特異性的重要方面。
1,、4 封閉,。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
2、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物
2,、1內(nèi)源性干擾物：類風濕因子（RF）,、黃疸等,，類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,，如用辣根過氧化物酶為標記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2,、2 外源性干擾物，常常因樣品采集,、貯存,、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染,，標本凝集不全等,。溶血標本，紅細胞溶解破裂,，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標記的ELISA測定中,，溶血標本可能會增加非特異性顯色,。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過氧化酶）[2],，有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3],。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此，血標本在采集處理時應小心,，在冰箱中保存不易過久,。
標本凝集不全時，血清中會殘留部分纖維蛋白原,，也易造成假陽性,。
3、操作過程中的問題造成假陽性
3,、1加樣
對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差,，尤其當稀釋倍數(shù)大時,，很小的誤差，會導致較大的相對誤差,，使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）,。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標本,，可較好地避免以上誤差,。
3、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結(jié)果的關(guān)健一步,，應引起操作者重視,。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結(jié)合的酶標記物的目的,。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。
3,、3 溫育
每種試劑都有其*反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素,。因孵育溫度高,，反應時間長，會造成整板本底高,，陽性率高,。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡,，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋,。
3,、4酶標儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標儀應定期進行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正,；其次酶標儀波長設(shè)置要正確,，使用雙波長，一個檢測波長,，一個參比波長,，以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外，在用酶標儀讀數(shù)時先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標儀性能有所不同,，使用中應詳細閱讀說明書
綜上所述,，由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標準化，盡管目前上以及我國有了部分標準血清或參比血清（血清盤）,。但由于受方法學及技術(shù)條件的限制,，在酶聯(lián)吸附測定中有時不可避免的會出現(xiàn)一定的非特異性，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,，從而提高檢測的特異性,，并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果