（二）步驟：先將抗原（或抗體）用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml,，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次,。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1:100,，1:200，1:400,，1:800,，1:1600（根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定），分別加入反應(yīng)孔中,，每個稀釋度二孔,，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌,。然后加底物液,，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘,。以2M H２SO4 0.05ml終止反應(yīng),。
（三） 結(jié)果判定：主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值，并以O(shè)D為縱座標,，結(jié)合物濃度為橫座標,，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,，且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度,，即為該標記物的工作濃度。
注意事項
1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下,，所要標記的抗體也要活性高,、效價高（zui低1:16）、純度高,、親和力好,，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件,。
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑,，（或必需）新鮮配制,。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體（雜質(zhì)）,。否則,，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光,，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜,。標記物每次透析前,，須認真檢查，防止漏液,。
4. 濃的標記物相當穩(wěn)定,，常加入30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年,，但稀釋成1:10,，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12小時內(nèi)用完,。切忌反復(fù)凍融,。
