免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結合,，然后用HRP等標記的二抗與一抗進行結合,，最后通過與DAB顯色劑反應，進而確認所要檢測蛋白抗原的定位,、半定量等目的,。
免疫組化更多的意義在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實現(xiàn),。

免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認不同細胞形態(tài)學改變,；而后者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的改變（數(shù)量）、也可檢測細胞內細胞因子的轉位,，組織中一些特異性蛋白的表達的量改變（通過圖像分析系統(tǒng)分析顏色深淺,、分布的面積等綜合分析）。
通俗的講,，HE僅僅是看大體病理改變,，比如組織壞死，比如炎性滲出,。免疫組化,，看你的目的蛋白的表達情況。

免疫組化和HE染色的對比
DAB和HE一樣也是一種染色劑,，HE染色相對簡單,，能分辨出細胞中的嗜酸嗜堿性物質；DAB染色全稱應該叫做免疫組化DAB染色,，經(jīng)過一系列復雜的生化反應后,，DAB(二氨基聯(lián)b胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。

常用的免疫組化染色方法:
組化用HRP的話,，信號不夠強,。通常用生物素標記HRP來增強信號。
1,、ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法）
ABC法是利用卵白素與生物素*的高度親和力特性,，與生物素化二抗結合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物,，最后DAB顯色,。
復合物配制：先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP,，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合,，形成卵白素-生物素-過氧化物酶復合物。
2,、SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復合物）
本身沒有連接生物素,，但有兩個生物素親和力的結合位點，可以與二抗上的生物素結合,，敏感性高,，復合物不需要使用前混合,，更為簡便。
3,、PAP法
4,、直接法

免疫組化結果分析
免疫組化結果的判斷原則：
1、必須設陽性對照和陰性對照,。
2,、 抗原表達必須在特定部位。
3,、 陰性結果不能視為抗原不表達,。

染色失敗的幾種情況及原因:
1、所染的全部切片均為陰性結果,，包括陽性對照在內,。
2、所有切片均呈陽性反應,。
3,、所有切片背景過深。
4,、陽性對照染色良好,，檢測的陽性標本呈陰性反應。

所有切片呈陽性反應,，其原因:
1,、切片在染色過程中抗體過濃，或干片了,。
2,、緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準確， 洗滌不干凈,。
3、使用已變色的呈色底物溶液,，或呈色反 應時間過長,。
4、抗體溫育的時間過長,。
5,、H₂O₂濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚,。

所有切片背景過深,，其原因:
1、內源性過氧化酶沒有阻斷,。
2,、切片或涂片過厚,。
3、漂洗不夠,。
4,、底物呈色反應過久。
5,、蛋白質封閉不夠或所用血清溶血,。
6、使用全血清抗體稀釋不夠,。

陽性對照染色良好,，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因:標本固定和處理不當,。

注意事項：
1,、蘇木素復染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置,。
2,、切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分,；每次加液前甩干洗滌液,，但又防止干片。
3,、以下原因可能導致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分,。可以60℃烤20min,，立即放入新鮮的二甲b中,。
②水化不全。應經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇,。
③抗體沒混勻,。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時,，切片放傾斜,。
⑤抗體孵育后PBS沖洗不充分。
⑥制片厚薄不均勻等問題,。
⑦染片盒不平,，切片傾斜。
4,、一抗的清洗:
1,、單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
2,、溫柔沖洗,，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式,。
3,、沖洗的時間要足夠，才能洗去結合的物質,。
5,、PBS的PH和離子強度的使用：
1、建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M,。
2,、中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利 于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解,；低離子強度有利于免疫復合物的形成,，而高離子強度則有利 于分解。
6,、拍照：
1,、有條件的話應該立即拍照，若不能及時拍照,，也要封好片和用指甲油封固,，保持避光和濕度。