實(shí)驗(yàn)方法原理：冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片,。它實(shí)際上是以水為包埋劑,，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。在冰凍切片前組織不經(jīng)過(guò)任何化學(xué)藥品處理或加熱過(guò)程,，大大縮短了制片時(shí)間,。同時(shí)，由于此法不需要經(jīng)過(guò)脫水,、透明和浸蠟等步驟,，因而較適合于脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片,，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷,。

實(shí)驗(yàn)材料：新鮮組織

試劑、試劑盒：H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性樹膠

儀器,、耗材：OCT速凍架恒冷箱切片機(jī)烘箱熒光顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟：

一取材

應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料,，防止組織發(fā)生死后變化。

二速凍

1,、將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）,。

2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織,，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi),。

3、當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v,，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中,，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。

4,、在制成凍塊后,，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。

5,、若需要保存,，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/span>

三固定

1,、樣品托上涂一層OCT包埋膠,，將速凍組織置于其上,，4℃冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織,。

2、取下組織置于錫箔或者玻片上,，樣品托速凍,。

3,、組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠,，以wanquan覆蓋為宜,，速凍架（PE）上30min。

四切片

1,、恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī),，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響,，可連續(xù)切薄片至5-10μm,。

2、切片時(shí),，低溫室內(nèi)溫度以-15℃ ~ -20℃為宜,，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng),，載玻片附貼組織切片,，切勿上下移動(dòng)。

3,、切好室溫放置30min后,，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min,。PBS洗5min×3,。

4、進(jìn)行抗原熱修復(fù),，微波熱修復(fù)也可,，室溫自然冷卻?？捎?%H2O2孵育5-10min,，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。

五免疫熒光染色

1,、冰凍切片室溫晾干15min,，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時(shí)（此步可不洗）。

2,、滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定,，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個(gè)過(guò)程中不會(huì)使組織干涸）,。

3,、將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜,。

4,、第二天先將濕盒放到37℃回溫1h,，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗,。

5,、滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1小時(shí)?；厥斩?，切片置于染缸內(nèi)，PBS洗5min×3次,。

6,、滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）,。

7,、回收DAPI，滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠,，用處理干凈的蓋玻片封片,，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

8,、做好的切片放在切片盒內(nèi),，置于4℃冰箱，可保存一周左右,。