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中級(jí)會(huì)員 | 第17年

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雌二醇的制備方法

時(shí)間:2022/11/17閱讀:1107
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制備方法:

采用人骨髓來源細(xì)胞使用化合物三甲基膽蒽(MCA)誘導(dǎo)產(chǎn)生并篩選出細(xì)胞,并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇,;所述細(xì)胞已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏號(hào)CCTCC C2012173;

制備步驟為:

1)人骨髓來源細(xì)胞(HMBDCs,主要成分為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)采用現(xiàn)有技術(shù)(本實(shí)施例采用骨髓沖洗,、貼壁法)進(jìn)行原代培養(yǎng)制備,制備的細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,,培養(yǎng)條件為37℃,,5%CO2,,直至105個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶;

2)培養(yǎng)基中加入MCA,,使其終濃度為1ug/ml,,并每星期更換含MCA的培養(yǎng)基2次;MCA處理1周后結(jié)束,;細(xì)胞在37℃,,5%CO2環(huán)境中,,持續(xù)常規(guī)培養(yǎng),;

3)培養(yǎng)至3個(gè)月,培養(yǎng)物中可見細(xì)胞中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣細(xì)胞,;上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志物:Oct4,、Nanos3、c-Kit,、DAZL,、Vasa;

4)培養(yǎng)液中檢測(cè)到雌二醇的持續(xù)表達(dá),,與未經(jīng)誘導(dǎo)處理hBMDCs(E2=65±14.8pmol/L,, n=6)相比,MCA誘導(dǎo)后hBMDCs中(E2=3243±947 pmol/L,, n=6)雌二醇的濃度高達(dá)50倍(p<0.01)差異有顯著性,;重新傳代后,觀察到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),,雌二醇濃度進(jìn)行性增加,,傳代培養(yǎng)至10天左右達(dá)到高峰,高達(dá)4500pmol/L,,隨后逐步下降,,最終維持到較高水平;

5)體內(nèi)雌二醇是由卵巢中卵泡合成,,在體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)后hBMDCs中,,觀察到卵泡樣結(jié)構(gòu)的形成(為誘導(dǎo)后hBMDCs中產(chǎn)生雌激素提供細(xì)胞支持);卵母細(xì)胞的發(fā)育需雌二醇的促進(jìn),,若缺乏雌二醇,,卵母細(xì)胞的最大只能長(zhǎng)到25微米;而誘導(dǎo)后hBMDCs中的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體積達(dá)到40-50微米,;免疫熒光證實(shí)上述大細(xì)胞為卵母細(xì)胞,;

6)卵泡相關(guān)基因,包括雌二醇合成的關(guān)鍵性基因:STAR,、p450arom,、p450c17,,以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因GDF9在培養(yǎng)物中表達(dá)(進(jìn)一步支持誘導(dǎo)后hBMDCs具有合成雌二醇的能力);

7)優(yōu)化培養(yǎng)條件,,增加雌二醇產(chǎn)生的能力,,并降低培養(yǎng)液中血清的濃度(有利于雌二醇的進(jìn)一步分離純化);上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞可進(jìn)一步增大產(chǎn)生早期卵泡樣結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞樣細(xì)胞,;

8)按現(xiàn)有方法分離,、純化,制得雌二醇,。

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