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帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳,。核酸電泳是進行核酸研究的重要手段,,是核酸探針、核酸擴增和序列分析等技術所*的組成部分,。核酸電泳通常在瓊脂糖凝膠或聚b烯酰胺凝膠中進行,,濃度不同的瓊脂糖和聚b烯酰胺可形成分子篩網(wǎng)孔大小不同的凝膠,可用于分離不同分子量的核酸片段,。
一,、瓊脂糖凝膠電泳
1.原理:
瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈,、透明的溶膠,,然后倒入膠模中,凝固后將形成一種固體基質(zhì),,其密度取決于瓊脂糖的濃度,。 將凝膠置電場中,在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網(wǎng)孔向陽極遷移,,遷移速率受到核酸的分子大小,、構(gòu)象、瓊脂糖濃度,、所加電壓,、電場、電泳緩沖液,、嵌入染料的量等因素影響,。在不同條件下電泳適當時間后,,大小、構(gòu)象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上,,從而達到分離的目的,。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣,用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA,。
二,、聚b烯酰胺凝膠電泳
1.原理:
聚b烯酰胺凝膠通過b烯酰胺單體、鏈聚合催化劑N,,N,,N’,,N’-四甲基乙二an(TEMED)和過硫酸an以及交聯(lián)劑N,,N’-亞甲雙b烯酰胺之間的化學反應而形成。b烯酰胺單體在催化劑作用下產(chǎn)生聚合反應形成長鏈,,長鏈經(jīng)交聯(lián)劑作用交叉連接形成凝膠,,其孔徑由鏈長和交聯(lián)度決定。鏈長取決于b烯酰胺的濃度,,調(diào)節(jié)b烯酰胺和交聯(lián)劑的濃度比例,,可改變聚合物的交聯(lián)度。 聚b烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)電泳樣品的電荷,、分子大小及形狀的差別達到分離目的,,兼具分子篩和靜電效應,分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳,??煞蛛x只相差1個核苷酸的DNA片段。 聚b烯酰胺凝膠電泳用于分析和制備長度小于1kb的DNA片段,。根據(jù)所要分離的核酸片段大小,,可制備不同濃度的凝膠。
三,、應用范圍:
瓊脂糖凝膠電泳適合分離,、純化200bp-50kB長度的核酸片段,廣泛應用于基因組提取與分析,、載體構(gòu)建,、質(zhì)粒提取等方面,分辨率較低,,相差100bp以內(nèi)的核酸片段較難分離,。
聚b烯酰胺凝膠電泳適合分離1kB以下的小核酸片段,適用于序列分析與比對,、核酶分析與鑒定,、小片段核酸的提取與分析等方面分辨率較高,,可以精確分離相差十幾至幾十bp的小片段核酸分子。
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