關(guān)于蛋白質(zhì)綴合的簡(jiǎn)捷方案你了解多少,？以下是使用SMCC和DTT詳細(xì)說明PE-蛋白質(zhì)綴合的方案,，供參考,。
注意：該方案使用IgG（MW：150kDa）作為其綴合蛋白,，但是其他蛋白質(zhì)可以用適當(dāng)修飾的量替代,。

PE準(zhǔn)備
注意：如果PE作為溶液（通常為硫酸銨）儲(chǔ)存，則必須首先進(jìn)行離心分離,。離心并棄去上清液,，然后在PBS中以與原溶液相同的濃度重建沉淀物。
如果PE以固體形式儲(chǔ)存,，立即懸浮在PBS中,。
對(duì)于計(jì)劃結(jié)合的每mg IgG，使用3.5 mg PE,。
1.將PE溶液透析,，每1升PE對(duì)1升PBS進(jìn)行透析,。重復(fù)一次,。
2.對(duì)每升PE的1升透析緩沖液*透析PE溶液。
3.通過測(cè)量280,565和620 nm處的吸光度來確保PE溶液的純度,。得到的565 / 620nm讀數(shù)大于50的比率是藻藍(lán)蛋白去除的指標(biāo),，并且565/280比率大于5表明溶液的進(jìn)一步純度。

PE衍生化（SMCC-PE）
1.在其用于以下步驟和綴合之前,，立即在DMSO中制備10mg / mL SMCC原液,。
2.每mg PE將11μlSMCC溶液加入到步驟1b產(chǎn)生的PE溶液中。將溶液包裹在鋁中,，孵育1小時(shí),，旋轉(zhuǎn)。
3.用交換緩沖液*平衡凝膠過濾柱,，并將前一步驟中的衍生化PE通過其上,。

減少IgG
1.在蒸餾水中制備1M DTT（15.4 mg /100μl）溶液。
2.在4mg / mL或更高的適當(dāng)緩沖液中制備IgG,。
3.通過在混合的同時(shí)每mL IgG溶液添加20μlDTT原液來產(chǎn)生20mM IgG溶液,。在沒有額外混合的情況下，站立30,。
4.用交換緩沖液平衡過濾柱,，并將還原的IgG通過,。從柱中收集0.25mL餾分并以大多數(shù)池合并。
一旦完成該步驟,，就完成以下結(jié)合,，并且完成步驟2（同時(shí)）。

共軛
1.每mg還原的IgG溶液加入3.2mg SMCC-PE,。用鋁包裹并在室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí),。
2.準(zhǔn)備10 mg NEM在1 mL DMSO中的溶液。
3.每mg IgG向IgG溶液中加入34μg,。再次包裹鋁并在室溫下旋轉(zhuǎn)20分鐘,。
4.可以將最終溶液透析或在柱上運(yùn)行到合適的緩沖液中。
注意：不要凍結(jié)結(jié)合物,。