什么是細(xì)胞培養(yǎng),？

有哪三種細(xì)胞培養(yǎng),？

細(xì)胞培養(yǎng)的條件是什么,？

細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟是什么？

定義:細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌,、適宜溫度,、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存,、生長,、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù),，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),。不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說,，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個*的過程,，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆,。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞,，這是克隆技術(shù)*的環(huán)節(jié),，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù),，通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞,，又可以借此研究細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝,、細(xì)胞的生長增殖等,。

細(xì)胞培養(yǎng)的分類：動物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng),、微生物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)的條件：

1．培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)基包含細(xì)胞生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物,、氨基酸,、無機鹽、維生素等,。針對不同細(xì)胞的營養(yǎng)需求,，有多種合成培養(yǎng)基可供選擇，如EBSS,、Eagle,、MEM、RPMll640,、DMEM等,。

2．其他添加成分

在各種合成培養(yǎng)基提供基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)之外，還需根據(jù)不同細(xì)胞和不同的培養(yǎng)目的添加其他成分,，如血清,、因子等。

血清提供的是細(xì)胞外基質(zhì),、生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白等重要物質(zhì),，常用的是胎牛血清。要根據(jù)不同的細(xì)胞和不同的研究目的決定添加血清的比例,。10%～20%的血清能維持細(xì)胞較快的生長增殖速度,，稱為生長培養(yǎng)液；為維持細(xì)胞緩慢生長或不死,，添加2%～5%的血清即可,，稱為維持培養(yǎng)液。但血清中也存在有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì),，如補體,、免疫球蛋白和一些生長抑制因子；成分不明確,，影響對結(jié)果的分析,；不同動物,、不同批次的血清活性差別較大，影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性,。

谷氨酰胺是細(xì)胞生長重要的氮源,，在細(xì)胞生長代謝過程中起重要作用，但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解,，4℃下放置7天即可分解約50%,，故谷氨酰胺需在使用前添加。

細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟：

一,、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移入15ml離心管中,，加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基,，輕輕吹勻，離心,，2000rpmX2min,，棄上清液。加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,，棄上清液,。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹打,，接種于10cm盤中,，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二,、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達到80%~90%時．去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次,。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min,。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,，2000rpmX2min，棄上清液,。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C）,，吹勻,，吸取10微升進行計數(shù),，按照1×105/盤接種，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三,、細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達到80%～90%時,，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次,。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,，2000rpmX2min,，棄上清液,。加入1ml凍存液（90%血清,，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇,，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi),，過夜,，第二天放入液氮中,，可以保存至少兩年,，如不放入液氮,，可以保存三個月,。

凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,，邊滴邊搖,。