ELISA檢測試劑盒中一般有3次加樣步聚,，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物,，加底物,。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并留意不行濺起,，不行發(fā)作氣泡,。

       
加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)則的量參加板孔中,。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，避免發(fā)作交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測定（如間接法 ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液,，再在其中參加血清標(biāo)本,，然后在微型震動器上震動1分鐘以保 證混和。加酶結(jié)合物使用液和底物使用液時可用定量多道加液器,，使加液進(jìn)程迅速完結(jié),。
 
在ELISA檢測試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,?？乖贵w反響的完結(jié)需要有一定的溫度和時刻，這一保溫進(jìn)程稱為溫育（incubation）,，有人稱之為孵育,，在ELISA中似不恰當(dāng)。     

ELISA屬固相,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)作。以抗體包被的夾心法為例,，參加板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有平等的和固相抗結(jié)合的時機(jī),，只要貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸,。這是一個逐漸平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)分散,，才干到達(dá)反響的結(jié)尾,。在這以后參加的酶符號抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這便是為什么ELISA反響總是需要一定時刻的溫育,。

溫育常采用的溫度有43℃,、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等,。37℃是試驗(yàn)室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度,。在建立ELISA方法作反響動力學(xué)研究時，試驗(yàn)表明,，兩次抗原抗體反響一般在37℃經(jīng)1-2小時,，ELISA檢測試劑盒產(chǎn)物的生成可達(dá)高峰。為加速反響,，可進(jìn)步反響的溫度,。

有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中,，以構(gòu)成多的沉積,。但因所需時刻太長，在ELISA中一般不予采用,。