細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來,，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗,。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,，起到了細胞保種的作用,。 

一、原理

在不加任何條件下直接凍存細胞時,，細胞內和外環(huán)境中的水都會形成冰晶,，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高,、滲透壓改變,、脫水、PH改變,、蛋白變性等,，能引起細胞死亡,。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低,。在緩慢的凍結條件下,，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成,。
細胞復蘇時速度要快,，使之迅速通過細胞易受損的－5～0℃，細胞仍能生長,，活力受損不大,。

目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性,，分子量小,，溶解度大，易穿透細胞,。

二,、細胞凍存與復蘇操作步驟

（一）凍存 

1、消化細胞（同實驗二）,，將細胞懸液收集至離心管中,。
2、1000rpm離心10分鐘,，棄上清液,。
3、沉淀加含保護液的培養(yǎng),，計數(shù),，調整至5×106/ml左右。
4,、將懸液分至凍存管中,，每管1 ml。
5,、將凍存管口封嚴,。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴,，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂,。
6、貼上標簽,，寫明細胞種類,，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩,。
7,、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘)→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱(－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮,。
注意：操作時應小心，以免液氮凍傷,。液氮定期檢查,，隨時補充，不能揮發(fā)干凈,，一般30立升的液氮能用1～1.5月,。

（二）復蘇 

1.  細胞實驗室進行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上,。
2.  培養(yǎng)液（DMEM）,、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37°C預熱20min，備用,。
3.  二甲基亞砜（DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min,，備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管,，立即放入400°C水浴中,，快速搖晃，直至凍存液*融化,。
5.  將細胞懸液移入15ml離心管,，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min,，5min）,。
6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度,，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.  記錄復蘇日期,。
 
三,、注意事項

1.  取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡,。此項尤為重要,，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,，可導致爆炸,。

2.  凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述,，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是*無毒副作用,，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大,，因此,，必須在1-2min內使凍存液*融化,。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷,，二甲基亞砜（DMSO）選擇進口產品,。

3.  離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度,，以減少對細胞的損傷。

4.  離心問題：目前主要有兩種見解,。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),，第二天換液。因為離心的目的是兩個,，去除 DMSO,，去除死細胞，這個是標準流程,，但對一般人來說,，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少,，細胞就全被扔掉了,，轉過了活細胞會受壓過大， 死亡,。此外在操作過程中容易污染,，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,，DMSO對細胞有一定的毒副作用,，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈,。我在試驗中按照常規(guī)的離心分裝的方法進行復蘇,，結果無有異常。

5.  細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液,，而在我的試驗中的經(jīng)驗總結為培養(yǎng)基越少細胞越容易貼附,。

6.  復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經(jīng)驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多,，細胞濃度過低,，不利于細胞的貼壁。

7.  加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,，從如果你加培養(yǎng)基的太少,，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響 細胞生長,，從以前的資料來看,，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響,，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度,。