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技術(shù)文章
PCR儀操作步驟
閱讀：5410 發(fā)布時(shí)間：2010-3-18 PCR的反應(yīng)包括三個主要步驟：分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers,。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱變性， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端,。 zui后在DNA聚合酶 e.g. Taq-polymerase 的作用下進(jìn)行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成,。
PCR技術(shù)神奇就神奇在以下幾個特點(diǎn)上：一是被擴(kuò)增的DNA所需量極小，理論上講一個分子就可以用于擴(kuò)增了,；二是擴(kuò)增效率高,，幾個小時(shí)就擴(kuò)增1000萬倍以上。現(xiàn)在PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究,、食品衛(wèi)生,、醫(yī)療、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術(shù),！
PCR的zui早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史,，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù),，Korana于1971年zui早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性,，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物,，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”,。
PCR的實(shí)現(xiàn)
1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA ,，寡核苷酸引物，DNA聚合酶,，合適的緩沖體系,，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間,。
PCR的改進(jìn)與完善
Mulliszui初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段,，其缺點(diǎn)是：
①Klenow酶不耐高溫,， 90℃會變性失活,，每次循環(huán)都要重新加。
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伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行,，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差,，合成的
DNA片段不均一,。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，
但由于Klenow酶不耐熱,，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí),，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成
一個擴(kuò)增反應(yīng)周期,，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難,。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引
起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視,。
1988年初,，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一,，真實(shí)性也較
高,，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次,，仍需加入新酶,。
1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種
耐熱DNA聚合酶,。 此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的
90%,，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%,，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40
%。②在熱變性時(shí)不會被鈍化,，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶,。③大大提高了擴(kuò)增片段特異
性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度2.0Kb,。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率,，因而其靈敏性也
大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別,，將此酶命名為Taq DNA多聚酶Taq DNA
Polymerase,。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。
獲得諾貝爾獎的PCR技術(shù)
1995年,，美國科學(xué)家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學(xué)獎,，他所取得的成就是發(fā)明了PCR技術(shù)。
PCR,，中文譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),，其實(shí)是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)，其擴(kuò)增效率之高就象核裂變的“鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”那樣,。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱的酶的作用,，可以在3個小時(shí)內(nèi)把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術(shù)一問世,，立刻引起了分子生物學(xué)研究的一場革命,，人們利用這種轟動*的技術(shù)很快就把微觀領(lǐng)域的生物學(xué)研究大大地往前推了一步?？梢赃@么說,，PCR技術(shù)使分子生物學(xué)研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術(shù)的日趨完善,，PCR在人類社會生活中的應(yīng)用也越來越廣泛,。比如說在“DNA指紋”中我們提到，科學(xué)家們只需要一根頭發(fā)甚至一個細(xì)胞就可以完成DNA指紋的鑒定工作,，這里實(shí)際上就要采用PCR技術(shù),，因?yàn)橐粋€細(xì)胞中的DNA含量實(shí)在太少了，人們根本不可能檢測到它的指紋,；有了PCR技術(shù)就好辦了,，通過PCR技術(shù)把這個細(xì)胞中的DNA片斷擴(kuò)增1000萬倍，這樣DNA量就足夠作指紋鑒定了。再比如,，在醫(yī)院里檢驗(yàn)血液中的某種病毒,，有時(shí)病毒量極少（例如有的艾滋病病毒攜帶者），通過傳統(tǒng)的檢查方法費(fèi)力又費(fèi)時(shí),，這時(shí)PCR技術(shù)也許就可以幫上忙,。可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA,，設(shè)計(jì)合適的引物DNA,，然后通過PCR技術(shù)一擴(kuò)增很快就可以判斷出血樣中是否擴(kuò)增出了大量的DNA，如果是的話,，那么就說明血樣中帶有該種病毒了,。PCR方法不但有*的靈敏度，而且可以同時(shí)一次做近百個擴(kuò)增反應(yīng),，省時(shí)省力效率高,。