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免疫膠體金技術(shù)
點擊次數(shù)：1334 發(fā)布時間：2017-10-23
免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù),，英文縮寫為：GICT。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷,、抗壞血酸,、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下,，聚合成為特定大小的金顆粒,，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金,。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷,，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性,。 膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外,，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA,、PHA,、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀,，如高電子密度,、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng),，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性,，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué),、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域,。
使用優(yōu)點
(1)使用方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場使用,，所有反應(yīng)能在15分鐘內(nèi)完成,；
(2)成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備,；
(3)應(yīng)用范圍廣,，可適應(yīng)多種檢測條件；
(4)可以進(jìn)行多項檢測,，若陽性樣本比較難獲得,，多項檢測可以節(jié)省樣品，降低成本,；
(5)標(biāo)記物穩(wěn)定,，標(biāo)記樣品在4℃貯存兩年年以上，無信號衰減現(xiàn)象,；
(6)膠體金本身為紅色,，不需要加入發(fā)色試劑，省卻了酶標(biāo)的致癌性底物及終止液的步驟,，對人體無毒害,。
顆粒制備
根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下,。
1．枸櫞酸三鈉還原法
（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01%HAuCl4水溶液100ml,，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min,，冷卻至4℃,，溶液呈紅色。
（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01%HAuCl4水溶液100ml,，加入1%枸櫞酸三鈉水溶液2ml,，加熱煮沸15min～30min,，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml,，混勻即可,。
（3）15nm、18nm～20nm,、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01%HAuCl4水溶液100ml,，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1%枸櫞酸三鈉水溶液4ml,、2.5ml,、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min,，出現(xiàn)橙紅色,。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、18～20nm,、30nm和50nm,。
2．鞣酸—枸櫞酸鈉還原法
A液：1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。
B液：1%枸櫞酸三鈉4ml,，1%鞣酸0.7ml,，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合,，加入雙餾水至20ml。
將A液,、B液分別加熱至60℃,，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍(lán),，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色,。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。
3．制備高質(zhì)量膠體金的注意事項
（1）玻璃器皿必須*清洗,，是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿,，或用*次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用,。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性,，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。
（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈,，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制,，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45mm）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì),。
（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好,。
（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘,，雜質(zhì)少。是進(jìn)口的,。
（5）氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定,，由于氯金酸易潮解，因此在配制時,，將整個小包裝一次性溶解,。
蛋白制備
膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點或偏堿的條件下,，二者容易形成牢固的結(jié)合物,。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，則會聚集而失去結(jié)合能力,。除此以外膠體金顆粒的大小,、離子強度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合,。
1．待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜,，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h,，去除聚合物,。
2．待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時,，調(diào)至9.0,；標(biāo)記McAb時,調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時,，調(diào)至7.6,；標(biāo)記SPA時，調(diào)至5.9～6.2,；標(biāo)記ConA時,，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時,，調(diào)至9～10,。
由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此,，在調(diào)節(jié)pH時,，采用精密pH試紙測定為宜。
3．膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定
（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管,，每管1ml,。
（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5mg/ml～50mg/ml,，分別取1ml,，加入上列金膠溶液中,，混勻,。對照管只加1ml稀釋液,。
（3）5min后,，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2h,，觀察結(jié)果,。
（4）結(jié)果觀察，對照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管,，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象,；而加入蛋白量達(dá)到或超過zui低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質(zhì)用量,，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的zui低用量,，在實際工作中，可適當(dāng)增加10%～20%,。
4．膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0,，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液,，繼續(xù)攪拌10min,，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血清（BSA）和1%聚乙二醇（分子量20KD）,。加入的量：5%BSA使溶液終濃度為1%,；1%聚乙二醇加至總?cè)芤旱?/10。
5．膠體金標(biāo)記蛋白的純化
（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小,，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間,。
用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min,，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g,，4℃離心1h,；20nm～40nm膠體金結(jié)合物，14 000g,，4℃離心1h,。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液（含0.02%NaN3）,，將沉淀重懸為原體積的1/10,，4℃保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18℃保存一年以上,。
為了得到顆粒均一的免疫金試劑,，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用10%～30%蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物,。
（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋,，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5～1/10,。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化,。層析柱為0.8 cm×20cm,，加樣量為床體積的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1%BSA,，0.05%NaN3,，pH8.2者用IgG標(biāo)記物），流速為8ml/h,。按紅色深淺分管收集洗脫液,。一般先濾出的液體為微黃色，有時略混濁,，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì),。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深,，清亮透明,，zui后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌,、分裝,4℃保存,。zui終可得到70%～80%的產(chǎn)量。
6．膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定
（1）膠體金顆粒平均直徑的測量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑,，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察,。或用醋酸鈾復(fù)染后觀察,。計算100個金顆粒的平均直徑,。
（2）膠體金溶液的OD520nm值測定：膠體金顆粒在波長510nm～550nm之間出現(xiàn)zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1%BSA,，0.02%NaN3）將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋,，OD520=0.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2～0.4,。
（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MF－IGSSA）,。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜,、微孔濾膜）,，用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測相應(yīng)的抗原或抗體，對金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。
組成結(jié)構(gòu)
膠體金作為免疫標(biāo)記物始于1971年,，由Faulk和Taylor將其引入免疫化學(xué),。Faulk 和Taylor首先將兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門氏菌的表面抗原,。此后,，他們還把膠體金與抗膠原血清，植物血凝素,，卵白蛋白,，人免疫球蛋白輕鏈、牛血清白蛋白結(jié)合應(yīng)用,。1974年Romano和他的同事們將膠體金標(biāo)記在馬抗人的IgG上,，實現(xiàn)了間接免疫金染色法。層析法檢測試劑zui早出現(xiàn)于1988年,，是Unipath公司利用染料顆粒開發(fā)生產(chǎn)的一種非常方便使用的懷孕檢測試劑,。1989年，Spielberg F等發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物用于檢測艾滋病毒抗體的滲濾法檢測試劑,，此后,，免疫膠體金在快速檢測試劑中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，相伴隨的層析法檢測試劑在組成結(jié)構(gòu),、生產(chǎn)用的材料等方面也取得了長足的進(jìn)步,。
目前市場上見到的典型的層析法檢測試劑的組成成份可分為三個部分，其一是多孔材料,，包括樣品墊,、吸水墊、結(jié)合墊及硝酸纖維膜,；其二是試劑,，如抗體、金標(biāo)結(jié)合物等,；其三是層壓結(jié)構(gòu)及卡盒,，如PVC板、雙面膠,、盒等（見表1及圖1）,。
表1 層析法免疫膠體金檢測試劑的組成成分
圖1 層析法免疫膠體金檢測試劑結(jié)構(gòu)示意圖
層析法檢測試劑的各組分，并非簡單的相互疊加,，改變其中的任一組分，都可能引起產(chǎn)品整體性能的變化,。以zui常見的早早孕檢測試劑為例,，影響其產(chǎn)品敏感度的因素可能有：
*硝酸纖維膜的特性，主要反應(yīng)在其流速上。
*膠體金顆粒的大小,，濃度等
*結(jié)合墊的性能,，金標(biāo)結(jié)合物的量
*樣品墊的特性
*檢測線的位置及寬度
*硝酸纖維膜和結(jié)合墊的疊壓強度
*捕獲抗體的親合力
*檢測線包被捕獲抗體的量
*結(jié)合抗體的特性
測試原理
層析法免疫膠體金檢測試劑實際上是免疫金標(biāo)記技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合而形成的一種應(yīng)用形式，相比ELISA試劑,，除標(biāo)記物不同外,，同樣服從于抗原抗體反應(yīng)的特性。此種檢測方法具有明顯的優(yōu)點：
*方便使用,，體現(xiàn)在操作簡單,，不需經(jīng)過特殊培訓(xùn)。
*短時間獲得檢測結(jié)果,，一般10－15分鐘即可得出結(jié)論,。
*不同環(huán)境下的穩(wěn)定性好，不需冷藏,。
*相比而言,，其生產(chǎn)成本和檢測成本均較低。
*檢測標(biāo)本種類多：可用于查血,、尿液或糞便,，因而適合各種檢查
應(yīng)用
膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡便，方法敏感,、特異,，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物,，也不要熒光顯微鏡,，它的應(yīng)用范圍廣，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外,，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等,。
1．液相免疫測定：將膠體金與抗體結(jié)合，建立微量凝集試驗檢測相應(yīng)的抗原,，如間接血凝一樣,，用肉眼可直接觀察到凝集顆粒。利用免疫學(xué)反應(yīng)時金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理,，建立均相溶膠顆粒免疫測定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地應(yīng)用于PCG的檢測,，直接應(yīng)用分光光度計進(jìn)行定量分析。
2．金標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)：膠體金可以明顯改變紅色激光的散射角,，利用膠體金標(biāo)記的羊抗鼠Ig抗體應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù),，分析不同類型細(xì)胞的表面抗原，結(jié)果膠體金標(biāo)記的細(xì)胞在波長632nm時,，90度散射角可放大10倍以上,，同時不影響細(xì)胞活性,。而且與熒光素共同標(biāo)記，彼此互不干擾,。
3．膠體金固相免疫測定法
（1）斑點免疫金銀染色法（Dot－IGS/IGSS）是將斑點ELISA與免疫膠體金結(jié)合起來的一種方法,。將蛋白質(zhì)抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應(yīng)后,，再滴加膠體金標(biāo)記的第二抗體,，結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)處發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點,，此稱為斑點免疫金染色法（Dot－IGS）,。此反應(yīng)可通過銀顯影液增強，即斑點金銀染色法（Dot－IGS/IGSS）,。
（2）斑點金免疫滲濾測定法（dot immuno－gold filtration assay,DIGFA）此法原理*同斑點免疫金染色法,，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料，即為滲濾裝置,。在加抗原（抗體）后,，迅速加抗體（抗原），再加金標(biāo)記第二抗體,，由于有滲濾裝置,，反應(yīng)很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng),。此方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測,。