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樹脂切片制作過程
點(diǎn)擊次數(shù):3044 發(fā)布時(shí)間:2016-11-25
一,、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
1.器具電子天平、70℃恒溫箱,、玻璃制刀機(jī),、半/超薄切片機(jī)、顯微鏡,、包埋模,、制刀用的玻璃條、鑷子,、刀片,。
2.試劑
(1)固定劑:FAA
(2)脫水劑:20%、40%,、60%,、80%、90%,、95%,、100%的乙醇;丙酮
(3)樹脂:Spurr樹脂
(4)染色劑:1%堿性品紅
二,、實(shí)驗(yàn)步驟
1.取材和固定:取樣時(shí)所用的器具必須干凈,,刀、剪等必須鋒利,,在操作時(shí)盡量避免拉,、鋸、壓等動(dòng)作對(duì)組織細(xì)胞造成的機(jī)械損傷,。一般樣品塊的大約為1立方毫米,,取材完成后立即放入固定液中,真空泵抽氣兩到三次,,每次1-2min(注意不要讓固定液沸出,,如抽完后液體較少,,可再補(bǔ)加固定液)。
2.脫水:用50%,、60%,、70%、85%,、95%,、100%的乙醇分別浸漬固定的材料,每種濃度處理10~15min
3.置換
(1)在管瓶中加入2ml無水乙醇和1ml丙酮,,處理材料10min
(2)向管瓶中追加1ml丙酮,,處理材料10min
(3)向管瓶中再追加2ml丙酮,處理材料10min
(4)傾倒出管瓶中的無水乙醇和丙酮混合液,,加入純丙酮3次,,每次10min。
4.浸透
(1)在管瓶中加入1ml丙酮,,向內(nèi)滴入1滴Spurr樹脂,,1~2h
(2)向管瓶中追加1至數(shù)滴Spurr樹脂,使Spurr樹脂的濃度逐漸提高,,每滴加一次Spurr樹脂,放置1~2h,,共滴加0.3ml左右的樹脂,,使樹脂濃度達(dá)到25%左右。
(3)用吸管吸去管瓶中0.5~0.8ml的丙酮和Spurr樹脂的混合液,,然后加入純Spurr樹脂0.5ml,,使樹脂濃度達(dá)到50%~60%左右,2~3h
(4)用吸管吸去管瓶中的丙酮和Spurr樹脂的混合液,,加入0.5~0.8ml的Spurr樹脂,,2~3h
(5)更換新配制的Spurr樹脂1ml,過
(6)重復(fù)換樹脂3次,,每次12h
5.包埋與聚合
(1)先將恒溫箱調(diào)至溫度至70℃,,包埋模事前烘干置干燥器中存放。
(2)在濕度小的房間里進(jìn)行包埋操作,。在包埋模的中放上已浸透的材料(用牙簽不損傷樣品地桃),,用滴管吸取新配制的Spurr樹脂,并注滿每個(gè)穴孔,,用牙簽撥樣品,,使樣品按一定方位(有利修塊、切片和觀察)排列,。做好記載(各穴孔中放的是什么樣品
(3) 聚合:將包埋樣品的包埋模放入70℃恒溫箱中聚合,,8h后取出置干燥器中存放,。多余的樹脂可放在膠囊中或放在包埋模的穴孔中同樣品一同聚合。
6.修塊
用銼刀或鐵砂皮磨樣品塊,,使樣品稍稍暴露,,使待切部位呈方形或長(zhǎng)方形,zui后用刀片將樣品塊的磨面切平
7.玻璃刀的制作
用玻璃制刀機(jī)先將玻璃條制成邊長(zhǎng)為25mm的正方塊,,然后再將每正方塊制作成2把璃制刀,。
8.切片、貼片
(1)固定樣品塊和玻璃刀
將樣品塊和玻璃刀固定在半薄切片機(jī)上,,玻璃刀的避樣品角約為5度,,切片機(jī)裝樣品部位平放時(shí),玻璃刀刀口與樣品塊處于同一高度,。調(diào)節(jié)玻璃刀前后位置,,使刀口接近樣品塊。
(2)荒切
開動(dòng)切片機(jī),,調(diào)節(jié)進(jìn)刀距離和速度,,讓玻璃刀荒切樣品塊,使樣品塊的切面逐漸平整光滑起來,。
(3)切片
當(dāng)樣品塊的切面平整光滑后便可正式切片,。作為光鏡觀察用的半薄切片厚度一般控制在1-2μm左右。
(4)貼片
當(dāng)切到理想切片時(shí),,用尖頭鑷子夾住切片,,并把切片釋放到滴有水滴的載玻片的水滴上,然后將載玻片放到烤片機(jī)上45℃烤片,,當(dāng)載玻片上的水滴被烤干時(shí)切片就被貼在載玻片上,。
(5) 染將堿性品紅染液均勻覆蓋在載玻片上,45℃烤干,,隨后用50%乙醇沖洗,,并再次把切片烘干。
(6)封片,,觀察
注意:透射電鏡樣品固定液為2.5%戊二醛溶液