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“XXXX”動物外周血單核細(xì)胞分離液實驗方法
【產(chǎn)品規(guī)格】
2×200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用,,試劑內(nèi)容如下:
| 名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 |
A | 試劑A |
| 200ml |
B | 試劑D |
| 200ml |
C | 樣本稀釋液(贈品) | 2010C1119 | 200ml |
D | 清洗液(贈品) | 2010X1118 | 200ml |
E | 說明書 |
| 1 份 |
【實驗前準(zhǔn)備】
A. 適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B. 耗材
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)地 |
15ml 離心管散裝 | 339650 | 美國 NUNC |
15ml 離心管架裝 | 339651 | 美國 NUNC |
50ml 離心管散裝 | 339652 | 美國 NUNC |
50ml 離心管架裝 | 339653 | 美國 NUNC |
無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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|
【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行,。
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例加全血及組織稀釋液(產(chǎn)品編號:2010C1119)混勻,,
根據(jù)稀釋后的樣本量大小,分以下兩種情況:
情況 A:稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時,,實驗方法如下:
1.取一支 15ml 離心管,,依次小心加入試劑 A、試劑 D(體積比為 3:2,,試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等,。如稀釋后的血液樣本為 5ml,則先后加入試劑 A 3ml,、試劑 D 2ml),,制成梯度界面,各液面分層一定要清晰,。
2.用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上,,400-550g,離心 20-30min(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,,血液樣本量越多,,離心力越大,離心時間越長,,具體離心條件需客戶自行摸索,,以達(dá)到*分離效果)。
3.離心后,,此時離心管中由上至下分為五層,。*層為稀釋液層。第二層為透明試劑 D 液層,。第三層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層,。第四層為透明試劑 A 液層。第五層為紅細(xì)胞層,。
4.用吸管小心吸取第二層試劑 D 層和第三層乳白色細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,,往所得離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118),混勻細(xì)胞,。
5.250g,,離心 10min。
6.棄上清,。
7.用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118)重懸所得細(xì)胞,。
8.250g,,離心 10min。
9.重復(fù) 6,、7,、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞,。
10.差異貼壁法純化細(xì)胞
(1)用單核細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號:CTBD2011)或單核細(xì)胞*培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號:HCTBD2011)以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細(xì)胞,,將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng),。
(2)2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞),。
(3)10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞,、干細(xì)胞,。(4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注:
a)無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分,,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清,。
b)*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。
C)由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的,,此法成本相對較低,。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。
情況 B:稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時,,實驗方法如下:
1.取一支適當(dāng)?shù)碾x心管,,依次小心加入試劑 A、試劑 D(試劑 A 與試劑 D 體積比為 5:3,,試劑總量與稀釋后的樣本量相等),,制成梯度界面。
2.將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上,,450-650g(zui大離心力可至 1000g),,離心 20-30min。(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,,血液量越多,,離心力越大,離心時間越長,,具體離心條件需客戶自行摸索,,以達(dá)到*分離效果。加入血液樣本后,,樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二),。
3.剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 10。
【注意事項】
1.全過程樣本,、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行,。為獲得*的實驗結(jié)果,在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實驗,,血液存放時間越長,,細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的,。
2.稀釋后血液樣本體積小于 3ml 時,,試劑 A 和試劑 D 用量分別為 2ml 和 1ml。
3.本實驗不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,,應(yīng)使用無靜電,、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁,、堿處理的玻璃表面會變成毛面,,影響細(xì)胞分離效果。
4.吸取過多的單核細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加,。
5.吸取過多的單核細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜,。
6.如所實驗后細(xì)胞得率或活性過低,請?zhí)旖驗笠詫で髱椭?,具體詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息,。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存,有效期 2 年,。本品易感染細(xì)菌,,需無菌條件操作。無菌條件下操作,,啟封后置常溫保存,。如 4℃保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,,影響分離效果,。
【參考值(參考范圍)】
本實驗單核細(xì)胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考,。
|
| 紅細(xì)胞 |
| 白細(xì)胞 |
| 血小板 |
|
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| (4.0-10.0)×109 |
| ||
含量(個/L) | (4.0-5.5)×1012 | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | (1.0-3.0)×1011 | |
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|
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
所獲得單核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)
所獲得單核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)
所獲得單核細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 | |
離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細(xì)胞密度過小 |
2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,,其密度與溫度,、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時,,恒定離心時間,對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),,全部使用藥用級原料,,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速,。
注:在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時,離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),,直至達(dá)到*分離效果,,
離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g,。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)
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