SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料,。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光,，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后,，熒光大大增強(qiáng)。因此,，SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān),，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I 的zui大吸收波長(zhǎng)約為497nm,，發(fā)射波長(zhǎng)zui大約為520nm,。

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SYBR Green I核酸染料(電泳用)

SYBR Green I是高靈敏的DNA熒光染料，適用于各種電泳分析,，操作簡(jiǎn)單：無(wú)須脫色或沖洗,。至少可檢出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍,。SYBR Green I 與dsDNA 結(jié)合熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800-1000倍,，用SYBR Green I染色的凝膠樣品熒光信號(hào)強(qiáng)，背景信號(hào)低?？蛇m用于多種電泳分析,。

SYBR Green I 適合于多種凝膠電泳方法：瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳,，脈沖電場(chǎng)凝膠電泳,，和毛細(xì)管電泳等。

SYBR Green I 與雙鏈DNA的親和力非常高,，因此可以用做電泳前染色,，對(duì)分子生物學(xué)中常用的酶（如：Taq 酶、逆轉(zhuǎn)錄酶,、內(nèi)切酶,、T4連接酶等）沒(méi)有抑制作用。另外,，SYBR Green I 與EB相比,，誘變能力大大降低。

SYBR Green I 核酸凝膠染液(SYBR Green Nucleic Acid Gel Stains)是一種高敏感性的熒光染液,，用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠及聚丙烯酰胺凝膠中的雙鏈DNA和寡核苷酸,。當(dāng)染液與核酸結(jié)合后,，SYBR Green I 核酸凝膠染液的熒光信號(hào)會(huì)明顯增強(qiáng),，因此經(jīng)SYBR GreenI 核酸凝膠染液染色的凝膠顯示出非常好的性?xún)r(jià)比，沒(méi)有背景熒光,。為獲得的結(jié)果,，凝膠在跑膠后再進(jìn)行染色。SYBR GreenI 核酸凝膠染液用于低含量的PCR產(chǎn)物,，凋亡研究及異源雙鏈分析中少量DNA的檢測(cè)較為理想,。可應(yīng)用于：DNA和RNA的檢測(cè),；SSCP及異源雙鏈分析,。

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SYBR Green I 核酸染料特點(diǎn)

高靈敏：至少可檢出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍,。

信噪比高：樣品熒光信號(hào)強(qiáng),，背景信號(hào)低。

操作簡(jiǎn)單：無(wú)須脫色或沖洗,。

適用范圍廣：可適用于多種電泳分析,。

使用方便：不影響其它修飾酶作用。

經(jīng)濟(jì)：價(jià)格比銀染便宜,。

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電泳用SYBR Green I 使用方法

SYBR Green I預(yù)染方法

1. 該方法適用于瓊脂糖凝膠電泳和PAGE凝膠電泳

2. 工作液的配制：用電泳緩沖液將10000×的SYBR GreenⅠ稀釋100倍,，即為SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一個(gè)月以上。

3. 制膠：按常規(guī)方法制膠,，不含任何染料,。

4. 樣品染色：向分析樣品中加入SYBR GreenⅠ工作液和載樣緩沖液，室溫放置10分鐘,，使SYBR GreenⅠ與樣品中DNA充分結(jié)合,。SYBR GreenⅠ工作液加入量為總上樣量的1/10。

5. DNA Marker染色：將5μL DNA Marker和1μLSYBR GreenⅠ工作液混勻,，室溫放置5分鐘,，使SYBR GreenⅠ與DNA充分結(jié)合。

6. 上樣,、電泳：按常規(guī)操作,。

7.檢測(cè)：用ABLUe可見(jiàn)光核酸檢測(cè)儀器檢測(cè)

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SYBR Green I后染方法

1. 按照常規(guī)方法進(jìn)行電泳。

2. 用PH 7.0 - 8.5 的緩沖液（如：TAE,，TBE 或 TE）,，按照10000：1的比例稀釋SYBR GreenⅠ濃縮液，混勻,，制成染色溶液,。

3. 將染色溶液倒入合適的聚丙烯容器中，放入凝膠,，用鋁箔等蓋住容器使染料避光,。室溫振蕩染色10-30分鐘，染色時(shí)間因凝膠濃度和厚度而定,。聚丙烯酰胺凝膠直接在玻璃平皿上染色,，將配好的工作溶液輕輕地倒在膠板上，讓工作液均勻地覆蓋整個(gè)膠板,，并染色30分鐘,。玻璃平皿必須預(yù)先經(jīng)過(guò)硅烷化溶液處理（避免染料吸附在玻璃表面上）。

4. 用ABLUe觀(guān)測(cè),。藍(lán)光可透過(guò)玻璃,，觀(guān)測(cè)聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，可直接將托有凝膠的玻璃平皿放入ablue內(nèi)觀(guān)測(cè),。

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SYBR Green I使用注意事項(xiàng)1. 在"SYBR GreenⅠ預(yù)染色方法"中,，電泳時(shí)間不要超過(guò)2小時(shí)，否則SYBR GreenⅠ會(huì)從DNA上分離出來(lái),，會(huì)產(chǎn)生彌散狀條帶,。

2. 在常規(guī)用酒精沉淀核酸的過(guò)程中，SYBR Green I 可以全部從雙鏈核酸上去掉,。

3. 如果想對(duì)用 SYBR Green I 染過(guò)的膠進(jìn)行 Southern blots,，建議在預(yù)雜化和雜化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS。

4. 在紫外照射透視下，與雙鏈 DNA 接合的 SYBR Green I 呈現(xiàn)綠色熒光,。如果膠中含有單鏈 DNA 則顏色為橘黃而不是綠色,。

5. SYBR Green對(duì)玻璃和非聚丙烯材料具有一定親合力。建議在稀釋,、貯存,、染色等使用過(guò)程中用聚丙烯類(lèi)容器。

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Sybr Green I染料法操作過(guò)程

1實(shí)驗(yàn)方法

囊腔組織經(jīng)液氮速凍后,，放入-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。Real-time PCR法檢測(cè)EMMPRIN的mRNA含量。

1.1組織總RNA提?。?/p>

（1）從液氮中取出組織,，用已處理過(guò)的剪刀剪取約100mg組織塊，加入1ml Trizol試劑,，轉(zhuǎn)移至勻漿器中,，將勻漿器置于冰水上充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的勻漿液至無(wú)RNA酶/無(wú)DNA酶的1.5ml離心管中,，室溫下靜置5min,。

（2）加入0.2ml氯仿，顛倒混勻10次充分混勻,，室溫下靜置2-5min,，4℃狀態(tài)下進(jìn)行離心，離心速度為12000r/min,，離心時(shí)間10min,；

（3）小心吸取上層水相溶液至另一無(wú)RNA酶/無(wú)DNA酶的1.5ml離心管中,，小心吸取上層水相,，勿碰及或吸走中間層，否則要重新離心再吸?。晌〖s0.4-0.5 ml）,。

（4）加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜止15min,，4℃狀態(tài)下進(jìn)行離心,，離心速度為12000r/min，離心時(shí)間15min,。小心棄上清,，沿管壁加入1ml 75%乙醇（DEPC水配置,預(yù)冷），室溫下靜置1min,，4℃狀態(tài)下離心,，速度7500r/min，離心時(shí)間5min；小心倒掉上清,，再4℃狀態(tài)下離心,，速度3500r/min，時(shí)間離心1min,；離心后用10μl槍頭小心吸去殘余液體,，zui后用30μlDEPC-H2O溶解RNA。

（5）提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定,，提取物濃度OD 260/280比值在1.8-2.0之間,。

1.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

用上述細(xì)胞中提取的2μg總RNA在下述20μl反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,該反應(yīng)體系組成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5mmol/L, RNA酶抑制劑（RNAsin) 20U。首先70?C預(yù)變性5min,，然后加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 200U,， 再于42?C孵育1h，72?C加熱10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶,。

1.3 Real-time PCR 反應(yīng)：

1.3.1 方法學(xué)確認(rèn) 根據(jù)引物相關(guān)信息PCR擴(kuò)增,，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并且對(duì)其純化，假設(shè)純化所得DNA濃度為a×10x,，對(duì)其做10倍梯度稀釋7次,，稀釋濃度依次為a×10x-1、a×10x-2,、a×10x-3,、a×10x-4、a×10x-5,、a×10x-6,、a×10x-7選擇合適稀釋品作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。

1.3.2 取上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物于20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng),。PCR引物由上海之江生物科技有限公司合成,。

PrimerSequence (5′to 3′)Length（bp）

GAPDH Forward primer5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'276

GAPDH Reverse primer5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'

EMMPRINForward primer5’- TGGCCTTCACGTTCCTGAGT -3’215

EMMPRINReverse primer5’ - GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’

反應(yīng)體系組成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP 10 mmol /L(0.4μl),、MgCl2 25mmol/L (1.6μl),、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl,、上,、下游特異引物各0.25μl、去離子水16.2μl,。

按下述熱循環(huán)參數(shù)運(yùn)行：GAPDH內(nèi)參照基因,；預(yù)變性：94×2min；變性：94×2s,，退火56×15s,，延伸72×15S（采光） 共30個(gè)循環(huán),。EMMPRIN基因；預(yù)變性：94×2min,；變性：94×2s,，退火58×15s，延伸72×12s （采光）共35個(gè)循環(huán),。以SLAN軟件分析并計(jì)算目的基因EMMPRIN與GAPDH的Ct值,。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1內(nèi)參照基因、目的基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果：隨機(jī)選擇3份標(biāo)本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，在理論片段大小位置有單一條帶且無(wú)雜帶和引物二聚體,。

2.2 試劑擴(kuò)增效率驗(yàn)證：經(jīng)過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品定量，內(nèi)參照基因GAPDH擴(kuò)增檢測(cè)Ct值與濃度對(duì)數(shù)值的相關(guān)系數(shù)為0.99996,，目的基因EMMPRIN擴(kuò)增檢測(cè)Ct值與濃度對(duì)數(shù)值的相關(guān)系數(shù)為0.99969,。內(nèi)參照基因和目的基因皆有良好的擴(kuò)增效率（相關(guān)系數(shù)>0.98）?？捎忙t法行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),。