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“XXXX”動(dòng)物外周血單核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

時(shí)間:2017/2/16閱讀:4038
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“XXXX”動(dòng)物外周血單核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法

技術(shù)文檔編號(hào):TBD0025SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】為方便廣大用戶使用,,試劑內(nèi)容如下:

 

名稱

產(chǎn)品編號(hào)

規(guī)格

A

分離液 1

 

200ml

B

分離液 2

 

200ml

D

清洗液(贈(zèng)品)

2010X1118

200ml

E

說明書

 

1 份

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】適用儀器:zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

檢驗(yàn)方法】全過程樣本,、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行,。

  方法一(需留取血漿備用)

1首先取抗凝血 250g 離心 10min,,棄血漿,,補(bǔ)加胎牛血清(添加量與棄去血漿量等同)制成細(xì)胞懸液,,根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積,,選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn),。

2取一支離心管,依次小心加入分離液 1,、分離液 2(體積比為 3:1,,試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2:  1。如細(xì)胞懸液為 2ml,,則先后加入分離液 1:3ml,、分離液 2:1ml。試劑總量zui不低于 4ml,。),,制成梯度界面,各液面分層一定要清晰,。

3用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上,,400-500g,離心 20-30min(注:根據(jù)血液樣本量確定 離心條件,,血液樣本量越多,,離心力越大,離心時(shí)間越長,,具體離心條件需客戶自行摸索,,以達(dá)到zui 佳分離效果),。

4離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為六層,。*層為稀釋液層,。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層(第 一層白環(huán)及上層 50%分離液 2)。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)),。第四層為透明分離液 1 液層,。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層,。

5用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中,,向所得離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào)2010X1118),混勻細(xì)胞,。

6 250g,,離心 10min。

7棄上清,。

8用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞,。

9 250g,離心 10min,。

10重復(fù) 6,、7、8,,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞,。分離圖例

方法二(不需血漿留存?zhèn)溆茫?/span>

1根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管,依次小心加入分離液 1,、分離液 2(體積比為 3:1,,試劑總 量與抗凝血體積比為 2:1。如抗凝血為 2ml,,則先后加入分離液 1:3ml,、分離液 21ml。試劑總量zui低不低于 4ml,。),,制成梯度界面,各液面分層一定要清晰,。

2用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上,,400-500g,離心 20-30min(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,,血液樣本量越多,,離心力越大,離心時(shí)間越長,,具體離心條件需客戶自行摸索,,以達(dá)到*分離效果),。

3離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為六層,。*層為血漿層,。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層(*層白環(huán)及上層 50%分離液 2)。第三層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)),。第四層為透明分離液 1 液層,。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層,。

4后續(xù)步驟同方法一,。

差異貼壁法純化細(xì)胞】

(1)用單核細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào):CTBD2011)或單核細(xì)胞*培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)HCTBD2011)以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,,放于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng),。

(2)2-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。

(3)10-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮,、內(nèi)皮祖細(xì)胞,、干細(xì)胞。

(4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞,。

   注:

a)無血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清,。

b)*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定),。

c)由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的,此法成本相對(duì)較低,。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選,。

【注意事項(xiàng)】

1全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行,。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,,在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),血液存放時(shí)間越長,,細(xì)胞分離效果越差,。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

2本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,,應(yīng)使用無靜電,、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁,、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面,,影響細(xì)胞分離效果。

3如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低,,請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭?/span>.

 【儲(chǔ)存條件及有效期】

  常溫保存,,有效期 2 年,。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作,。無菌條件下操作,,啟封后置常溫保 

  存。如 4℃保存,,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,,影響分離效果。

【參考值(參考范圍)】

本實(shí)驗(yàn)單核細(xì)胞提取率大于 80%,。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

1所獲得單核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù),。

2所獲得單核細(xì)胞的核酸提取技術(shù),。

3所獲得單核細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:

出現(xiàn)情況

出現(xiàn)原因

建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層

轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短

適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中

轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長

離心后白環(huán)層彌散

細(xì)胞密度過大

調(diào)整細(xì)胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見

細(xì)胞密度過小

 

2本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,,其密度與溫度,、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),,恒定離心時(shí)間,對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整,。

3本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),,全部使用藥用級(jí)原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,,可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

  注:在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),,離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),,直至達(dá)到*分離效果,離

  心力zui小不得小于 400g,,zui大不得大于 1200g,。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。

 

 

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