“XXXX”動物外周血單核細胞分離液實驗方法

技術(shù)文檔編號：TBD0025SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】為方便廣大用戶使用,，試劑內(nèi)容如下：

【實驗前準備】適用儀器：zui大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機

【檢驗方法】全過程樣本,、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行,。

  方法一（需留取血漿備用）

1首先取抗凝血 250g 離心 10min,，棄血漿,，補加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細胞懸液，根據(jù)細胞懸液液體體積,，選擇適當離心管進行試驗,。

2取一支離心管，依次小心加入分離液 1,、分離液 2（體積比為 3:1,，試劑總量與細胞懸液體積比為 2：  1。如細胞懸液為 2ml,，則先后加入分離液 1：3ml,、分離液 2：1ml。試劑總量zui少不低于 4ml,。）,，制成梯度界面，各液面分層一定要清晰,。

3用吸管小心吸取細胞懸液加于分離液液面上,，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定 離心條件,，血液樣本量越多,，離心力越大，離心時間越長,，具體離心條件需客戶自行摸索,，以達到zui 佳分離效果）。

4離心后,，此時離心管中由上至下分為六層,。*層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色單核細胞層（第 一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）,。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）,。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞層,。第六層為紅細胞層,。

5用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號2010X1118）,，混勻細胞,。

6 250g，離心 10min,。

7棄上清,。

8用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

9 250g,，離心 10min,。

10重復 6、7、8,，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞,。分離圖例

方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?/span>

1根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管，依次小心加入分離液 1,、分離液 2（體積比為 3:1,，試劑總 量與抗凝血體積比為 2：1。如抗凝血為 2ml,，則先后加入分離液 1：3ml,、分離液 2：1ml。試劑總量zui低不低于 4ml,。）,，制成梯度界面，各液面分層一定要清晰,。

2用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上，400-500g,，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件,，血液樣本量越多，離心力越大,，離心時間越長,，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果）,。

3離心后,，此時離心管中由上至下分為六層。*層為血漿層,。第二層為環(huán)狀乳白色單核細胞層（*層白環(huán)及上層 50%分離液 2）,。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層,。第五層為粒細胞層,。第六層為紅細胞層。

4后續(xù)步驟同方法一,。

【差異貼壁法純化細胞】

（1）用單核細胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：CTBD2011）或單核細胞*培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：HCTBD2011）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細胞,，將細胞鋪于一次性細胞板或細胞瓶中，放于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng),。

（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）,。

（3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細胞,、干細胞,。

（4）不貼壁的為淋巴細胞。

   注：

a)無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清,。

b)*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細胞而定）,。

c)由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成本相對較低,。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選,。

【注意事項】

1全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行,。為獲得*的實驗結(jié)果,，在取血 2h 內(nèi)進行實驗，血液存放時間越長,，細胞分離效果越差,。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

2本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品,，應使用無靜電,、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁,、堿處理的玻璃表面會變成毛面,，影響細胞分離效果。

3如所實驗后細胞得率或活性過低,，請?zhí)旖驗笠詫で髱椭?/span>.

 【儲存條件及有效期】

  常溫保存,，有效期 2 年。本品易感染細菌,，需無菌條件操作,。無菌條件下操作，啟封后置常溫保 

  存,。如 4℃保存,，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果,。

【參考值（參考范圍）】

本實驗單核細胞提取率大于 80%,。

下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考,。

【相關(guān)實驗技術(shù)方案】

1所獲得單核細胞的培養(yǎng)技術(shù),。

2所獲得單核細胞的核酸提取技術(shù)。

3所獲得單核細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1.由于血液粘度,、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心,，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān),。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整,。建議對離心條件進行調(diào)整時,，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整,。

3本分離液依照標準,，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,，可能出現(xiàn)紅細胞沉降不*的情況,，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。

  注：在對離心條件進行調(diào)整時,，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),，直至達到*分離效果，離

  心力zui小不得小于 400g,，zui大不得大于 1200g,。離心時間以 20-30min 為準。