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基于需要遞轉(zhuǎn)不同種類核酸/蛋白類型研究,，在細胞轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)，研究者們常碰到如下三類問題：

1. 細胞對化學(xué)試劑較為敏感,，轉(zhuǎn)染后,，細胞活率下降或死亡；

2. 研究常用細胞類型較多,，不同類型細胞,，轉(zhuǎn)染效率差異較大,，導(dǎo)致單個轉(zhuǎn)染試劑或者實驗流程，無法滿足實驗需求,；

3. 遞轉(zhuǎn)多種類型核酸或蛋白,，需要挑選對應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑，并且需要大量實驗優(yōu)化,，才可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率,。

有沒有一款化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑，可以同時應(yīng)對常規(guī)到難轉(zhuǎn)染的細胞類型,，有著較低的細胞毒性,，并且適用于多種核酸/蛋白類型遞轉(zhuǎn)呢？兼具多重功能,、高性能的TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑,，可同時應(yīng)對常見細胞及難轉(zhuǎn)染細胞類型，避免條件摸索和大量的重復(fù)性實驗,，輕松得到您理想的實驗結(jié)果。

• 已驗證在大多數(shù)細胞類型中（如貼壁/懸浮細胞,、原代細胞,、神經(jīng)細胞等），都有著優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率,、低毒性（特別相對于形成脂質(zhì)體復(fù)合物的Lipofectamine®系列試劑）,、高性能的表現(xiàn)；

• 適用于多種研究領(lǐng)域,，包括但不限于干細胞研究,、基因編輯CRISPR研究、RNAi基因干擾/沉默,、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建,、低毒性的轉(zhuǎn)染實驗、共轉(zhuǎn)染實驗等,；

• 允許高效且穩(wěn)定的同時遞轉(zhuǎn)多種核酸/蛋白類型,，包括但不限于質(zhì)粒 DNA、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 組分,。

為什么Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System有著如此高性能及廣泛適應(yīng)性呢,？這歸因于Mirus強大且高效的遞轉(zhuǎn)平臺設(shè)計，可進行多重,、多功能組合的轉(zhuǎn)染試劑組分篩選并優(yōu)化,。成立于1995年的Mirus，專注及深耕核酸遞轉(zhuǎn)領(lǐng)域多年（圖1）,，從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別,、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN®,，都是基于該遞轉(zhuǎn)平臺進行設(shè)計及開發(fā)的。截至目前,，使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過1萬篇,，并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫涵蓋了超過1200種細胞類型，更多文章及數(shù)據(jù)查詢,，請點擊這里,。

圖1 Mirus產(chǎn)品年鑒

不同于傳統(tǒng)基于單組分的轉(zhuǎn)染試劑（如陽離子聚合物或陽離子脂質(zhì)體），為了進一步提高轉(zhuǎn)染效率,，以應(yīng)對不同細胞類型或特定的應(yīng)用,。Mirus將多聚物(Polymer)及脂質(zhì)(Lipids)技術(shù)進行多重組合，在不形成脂質(zhì)體復(fù)合物（即liposome,，通常具有細胞毒性）前提條件下,，得到多種類、高性能的轉(zhuǎn)染方案,，克服細胞遞轉(zhuǎn)過程中的多重阻礙,，以實現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低的細胞毒性（圖2）。

圖2 Mirus轉(zhuǎn)染試劑原理示意圖

基于上述Mirus強大,、高效的遞轉(zhuǎn)平臺設(shè)計,，在進行多重、多組合篩選,、優(yōu)化及后續(xù)驗證,，智能迭代設(shè)計流程，優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)中的每個組分（圖3）,。Mirus推出一系列經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑,，以應(yīng)對多種需求：

1. 廣譜、高性能,、低毒性的轉(zhuǎn)染試劑家族: TransIT-X2®,、TransIT®-LT1、TransIT®-2020

2. 針對特定細胞類型的轉(zhuǎn)染試劑家族：TransIT®-293,、TransIT®-BrCa,、TransIT®-CHO、TransIT-HeLaMONSTER®,、TransIT®-Insect,、TransIT®-Jurkat、TransIT®-Keratinocyte

3. 針對特定應(yīng)用的轉(zhuǎn)染試劑家族：

-      病毒生產(chǎn)：VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑及配套試劑盒,、TransIT®-Lenti

-      蛋白/抗體生產(chǎn)：TransIT-PRO®,、CHOgro® Expression System、CHOgro® High Yield Expression System

4. 寡核苷酸遞轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染家族：TransIT®-Oligo、TransIT-siQUEST®,、TransIT-TKO®

5. mRNA及長鏈RNA遞轉(zhuǎn)：TransIT®-mRNA

圖3 Mirus智能迭代設(shè)計,，轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化流程示意圖

Mirus TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑性能數(shù)據(jù)展示

Mirus TransIT-X2®Dynamic Delivery System遞轉(zhuǎn)表達EGFP質(zhì)粒DNA分別至A549、CHO-K1,、Hep G2,、MDCK、LNCaP,、PC-12,、原代人乳腺上皮細胞(HMEC)和正常人真皮成纖維細胞(NHDF)細胞中。實驗使用96孔板,， TransIT-X2®試劑加入量為0.2-0.4µl,，DNA加入量為0.1µg(使用試劑:DNA=2:1、3:1或4:1),。轉(zhuǎn)染后48小時,，使用Guava® easyCyte™ 5HT流式細胞儀重復(fù)檢測三次，評估轉(zhuǎn)染效率,。

圖4 TransIT-X2®在包括原代細胞在內(nèi)的多種細胞類型中都具有較高轉(zhuǎn)染效率

使用TransIT-X2®(Mirus Bio),、Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine®3000 (Thermo Fisher Scientific)轉(zhuǎn)染熒光素酶編碼質(zhì)粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)細胞中，轉(zhuǎn)染24小時,，通過熒光素酶活性評估轉(zhuǎn)染效率,，定量受損細胞中釋放的LDH評估細胞毒性。與Lipofectamine®2000或Lipofectamine®3000的細胞相比,，在最佳試劑:DNA比例下，Trans - x2®有著更高的熒光強度及更低的細胞毒性,。

圖5 相較于使用單一組分且形成陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物(liposome)的Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑,，TransIT-X2®有著更高的轉(zhuǎn)染效率及更低細胞毒性

實驗Tips: 針對更多特定細胞類型，試劑使用建議,，詳細請見：Cell-type specific transfection protocol recommendations (PDF).

Mirus TransIT-X2®在RNAi干擾實驗中性能數(shù)據(jù)展示

基因沉默相關(guān)功能研究在分子和細胞生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用,，化學(xué)轉(zhuǎn)染也在該研究領(lǐng)域扮演者重要角色。常見參與RNAi干擾途徑的天然RNA分子包括：

-      小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) ：由雙鏈 RNA(dsRNA)斷裂所產(chǎn)生的短雙鏈 RNA(20-25bp),；

-      微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) ：非編碼 RNA 處理后所產(chǎn)生的一類短的,、單鏈 RNA(20-22nt)。

利用 RNAi 抑制基因表達的另一種方法為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA , shRNA),，這些短 RNA 序列可通過病毒或非病毒載體方式進行表達,，更多詳細信息可查閱Mirus Applications | RNAi Gene Silencing。

圖6  不同RNAi干擾途徑示意圖

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染siRNA(靶點為內(nèi)源性蛋白質(zhì)- GAPDH和AHA1),，對照使用正常人類真皮成纖維細胞(NHDF)遞轉(zhuǎn)非靶向siRNA,。Trans IT-X2®加入量為4µl， Lipofectamine®2000加入量為6µl,，siRNA加入量都為25 nM,。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平測量GAPDH或AHA1 mRNA進行檢測,，轉(zhuǎn)染后48小時均一化至非靶向?qū)φ战M的mRNA水平，誤差則為三次復(fù)孔實驗的標準差,。

圖7  基于siRNA核酸遞轉(zhuǎn)類型的基因沉默研究,，相比Lipofectamine® 2000，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana™ miRNA mimic, miR-1 (兩者都已驗證,，可降低PTK9 mRNA表達水平),。Pre-miR™陰性質(zhì)控用于評估mRNA表達水平基線值。Trans IT-X2®及Lipofectamine®2000試劑加入量都為3µl,， 加入50 nM miRNA,。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平，經(jīng)過陰性質(zhì)控的均一化,，得到PTK9 mRNA表達水平值,。

圖8  基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000,，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

Mirus TransIT-X2®在CRISPR基因編輯實驗中性能數(shù)據(jù)展示

經(jīng)過改造及優(yōu)化的細菌 CRISPR/Cas9 系統(tǒng),，已被廣泛應(yīng)用到哺乳細胞的基因編輯中?；?/span>CRISPR基因編輯實驗常見兩組分：Cas9蛋白及引導(dǎo)RNA(gRNA),。當Cas9蛋白切割了靶向基因組DNA，會觸發(fā)兩種內(nèi)源性修復(fù)機制,，即非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(fù)(HDR),，以應(yīng)對細胞中產(chǎn)生的DNA斷裂?；?/span>NHEJ細胞修復(fù)通路,，為非精準、且容易出錯細胞修復(fù)通路,，可引入導(dǎo)致基因功能缺失的Indel,。基于HDR的細胞修復(fù)通路,，則需要額外的同源 DNA 作為修復(fù)模板,，從而實現(xiàn)“精準"修復(fù)，在目的基因插入特定的基因或長片段序列,。

根據(jù)研究者們不同的實驗需求,，CRISPR基因編輯可以有多種類型實驗設(shè)置，這意味需要面對不同核酸類型的轉(zhuǎn)染甚至共轉(zhuǎn)染,，舉例如下：

1.      質(zhì)粒pDNA轉(zhuǎn)染

作為CRIPSR實驗關(guān)鍵兩組分：Cas9蛋白及gRNA,，可以設(shè)計單個質(zhì)粒DNA，共同表達兩組分(A)；或者使用兩質(zhì)粒系統(tǒng),，其中一個質(zhì)粒表達Cas9蛋白,，另外一個質(zhì)粒表達gRNA(B)；當使用Cas9切口酶(Nickase),，則需要兩條gRNA,，這時可能需要三質(zhì)粒系統(tǒng)的遞轉(zhuǎn)實驗。

2.      質(zhì)粒DNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染

此時,，與上述實驗設(shè)計不同的是,，gRNA以寡核苷酸形式進行遞轉(zhuǎn)，這就意味著遞轉(zhuǎn)實驗需要同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B),。

3.      mRNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染

為了避免由于質(zhì)粒DNA基因組整合而導(dǎo)致的脫靶效應(yīng),，可以共轉(zhuǎn)染編碼Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸)。

4.      Cas9/gRNA RNP復(fù)合物遞轉(zhuǎn)

隨著Cas9蛋白及gRNA商品化趨于成熟,，越來越多的研究者們選擇直接從第三方購買高保真Cas9蛋白,，以及有著額外化學(xué)修飾且在細胞內(nèi)更穩(wěn)定的gRNA寡核苷酸。除了極大的縮短和簡化CRISPR實驗流程外,，相對于質(zhì)?；蛘?/span>mRNA方式合成，直接遞轉(zhuǎn)RNP復(fù)合物的方式有著更高的特異性及編輯效率,。

實驗Tips: 針對上述不同CRISPR實驗設(shè)計及遞轉(zhuǎn)情形,，TransIT-X2® Dynamic Delivery System經(jīng)優(yōu)化的具體實驗說明， 下載鏈接如下：

TransIT-X2® for CRISPR Plasmid + gRNA Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP + ssODN Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP Delivery (PDF)

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System  (2 µl/孔,，24孔板, Mirus Bio)共轉(zhuǎn)染0.5 µg質(zhì)粒DNA(表達Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF細胞中,，轉(zhuǎn)染后48小時，T7E1驗證切割效率,。

圖9 質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染：TransIT-X2®分別在293T/17,、U2OS和NHDF細胞中共轉(zhuǎn)Cas9質(zhì)粒DNA與gRNA(RNA寡核苷酸)，都有著較高的基因編輯效率(18-48%)

2-part gRNA (PPIB基因,，IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP復(fù)合體,，分別使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System(1 µl/孔,， Mirus Bio),、Lipofectamine® CRISPRMAX™ (1.5 µl/孔， ThermoFisher) ,、Lipofectamine® RNAiMAX (1.5 µl/孔, ThermoFisher) ,、Lipofectamine® 3000 (1.5 µl/孔ThermoFisher) 遞轉(zhuǎn)至293T/17及U2OS細胞中。測試gRNA兩種使用量(6 nM或12 nM),，相同Cas9 蛋白加入量(6 nM),，轉(zhuǎn)染后48小時，T7E1驗證切割效率。

圖10 Cas9/gRNA RNP復(fù)合體遞轉(zhuǎn)：相較于Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑,，TransIT-X2®有著更高的切割效率

Mirus TransIT-X2®產(chǎn)品優(yōu)勢

?新型基于多組分開發(fā)的廣譜型轉(zhuǎn)染試劑(適用于多種細胞,，包括難轉(zhuǎn)細胞)；

? 可同時轉(zhuǎn)染核酸及蛋白,，包括不限于DNA,，siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9復(fù)合物；

?不形成脂質(zhì)體復(fù)合物,，降低細胞毒性,；

? 滿足多種應(yīng)用：基因過表達、基因沉默,、基因編輯,、干細胞研究、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建等,。

相關(guān)產(chǎn)品信息

文末福利：

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美國Mirus公司成立于1995年,，是世界上很早開發(fā)高效,、低毒轉(zhuǎn)染試劑的公司，同時也是目前該類試劑主要的供應(yīng)商之一,。Mirus其許多杰出成果獲得廣大用戶的好評,。

北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)代理，始終秉承著專業(yè),、嚴謹?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù),。