細(xì)胞凍存的一般方法 
 
開(kāi)始細(xì)胞凍存前,，仔細(xì)檢查細(xì)胞凍存所需的儀器和試劑是否齊全：一般主要有：傳代細(xì)胞單層、適宜生長(zhǎng)液,、滅活小牛血清、慶大霉素溶液,、7.5％NaHC03溶液,、0.25％胰蛋白酶溶液、標(biāo)簽用具：100ml方瓶（培養(yǎng)細(xì)胞用）,、克氏瓶,、紅翻帽塞、吸管（10ml,、lml）,、細(xì)胞凍存管、二甲基亞砜,、CO2孵箱,、超掙臺(tái)、倒置顯微鏡,、2～8℃冰箱,、-20℃冰箱、液氮罐

操作步驟

鏡檢細(xì)胞,，挑選培養(yǎng)3～4天的細(xì)胞,，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)污染,、異常及可疑病變細(xì)胞,。配制細(xì)胞培養(yǎng)液：根據(jù)不同的細(xì)胞需用不同的基礎(chǔ)液，培養(yǎng)液配方為（基礎(chǔ)液：7.5%碳酸氫鈉：1萬(wàn)單位慶大霉素=100：1：0.25）,。制備細(xì)胞懸液：挑選培養(yǎng)3—4天的細(xì)胞,，細(xì)胞界限清晰,，具有立體感，細(xì)胞形態(tài)良好的單層細(xì)胞瓶,，棄去培養(yǎng)液,，先用PBS洗液沖洗細(xì)胞表面1-2次，再向克氏瓶中加入0.25%胰酶8ml,，等細(xì)胞面開(kāi)始出現(xiàn)裂縫時(shí)倒掉瓶中部分胰酶,，大克氏瓶中保留2 ml，放置幾分鐘使細(xì)胞*脫落到胰酶中,，收集含細(xì)胞的胰酶,，并用培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞瓶3-4次，收集沖洗液,；向收集液中補(bǔ)加以下物質(zhì)：小牛血清使終濃度為20%,、二甲基亞砜使終濃度為9%；分裝：將細(xì)胞懸液混勻后,，立即分裝于細(xì)胞凍存管中,，每管按1～1.6ml的量分裝，擰緊管蓋,；在凍存管上做好標(biāo)記,，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期等。

凍存

先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（2～8℃）,，約3-4h,；接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室，約3-4 h,；然后將凍存管放置液氮灌口,，過(guò)夜；zui后將凍存管投入液氮保存,。記錄：記錄內(nèi)容包括凍存日期,、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù),、凍存過(guò)程中降溫的情況,、凍存位置以及操作人員。




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