大鼠低氧誘導(dǎo)因子1a（HIF-1α）ELISA 檢測(cè)試劑盒

本試劑僅供研究使用  標(biāo)本：血清或血漿

試驗(yàn)原理：

HIF-1α試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知HIF-1α濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),。先將HIF-1α和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP,。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A,、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用,。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中HIF-1α的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制

自備材料

1．  蒸餾水,。

2．  加樣器：5ul、10ul,、50ul,、100ul、200,、500ul,、1000ul。

3．  振蕩器及磁力攪拌器等,。

安全性

1．  避免直接接觸終止液和底物A,、B。一旦接觸到這些液體,，請(qǐng)盡快用水沖洗,。

2．  實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3．  不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

操作注意事項(xiàng)

1．  試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存,，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,，不可保存,。

2．  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存,，以免變質(zhì),。

3．  不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。

4．  使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A,、B液時(shí),，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5．  使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。

6．  洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水,。

7．  底物A應(yīng)揮發(fā),，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感,，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下,。避免用手接觸,，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值,。

8．  加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣,。

9．  按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作,。

樣品收集、處理及保存方法

1,、  血清-----操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。

2、  血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

3,、  細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4,、  組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎,。1000×g離心10分鐘,，取上清液

5、  保存------如果樣品不立即使用,，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒,，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

試劑的準(zhǔn)備

1．  標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

2．  洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟

1．  使用前，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差,。

2．  根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

3．  加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育1小時(shí)。

4．  甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。

5．  每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘,。

6．  甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。

7．  每孔加入底物A,、B各50ul，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘,。避免光照。

8．  取出酶標(biāo)板,，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。

9．  在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。

建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

局限

6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng),。

3. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié)果 判 斷 與 分 析

1,、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的HIF-1α標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）,，做得相應(yīng)的曲線,，樣品的HIF-1α含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3,、檢測(cè)值范圍：0-800pg/ml

4,、敏感度： 1.0 pg/ml