大鼠低氧誘導因子1a（HIF-1α）ELISA 檢測試劑盒

本試劑僅供研究使用  標本：血清或血漿

試驗原理：

HIF-1α試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知HIF-1α濃度的標準品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測,。先將HIF-1α和生物素標記的抗體同時溫育,。洗滌后,，加入親和素標記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A、B,，和酶結(jié)合物同時作用,。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中HIF-1α的濃度呈比例關(guān)系,。

試劑盒內(nèi)容及其配制

自備材料

1．  蒸餾水,。

2．  加樣器：5ul,、10ul、50ul,、100ul,、200、500ul,、1000ul,。

3．  振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1．  避免直接接觸終止液和底物A,、B,。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗,。

2．  實驗中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品。

3．  不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

操作注意事項

1．  試劑應按標簽說明書儲存,，使用前恢復到室溫,。稀稀過后的標準品應丟棄,，不可保存。

2．  實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,，密封保存,，以免變質(zhì)。

3．  不用的其它試劑應包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用。

4．  使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A,、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器,。

5．  使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6．  洗滌酶標板時應充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水,。

7．  底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,，有毒,。實驗完成后應立即讀取OD值,。

8．  加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣,。

9．  按照說明書中標明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集,、處理及保存方法

1,、  血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2,、  血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測,。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

3、  細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4,、  組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,，取上清液

5,、  保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存,，避免反復冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

試劑的準備

1．  標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備,，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進行：

2．  洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟

1．  使用前,，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差,。

2．  根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi),。

3．  加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔,、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。

4．  甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復此操作3次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

5．  每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘,。

6．  甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復此操作3次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

7．  每孔加入底物A,、B各50ul,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘,。避免光照,。

8．  取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果,。

9．  在450nm波長處測定各孔的OD值,。

建議使用的實驗方案

局限

6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果,。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品,。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應,。

3. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%,。

結(jié)果 判 斷 與 分 析

1,、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y）,，相應的HIF-1α標準品濃度為橫坐標（X）,，做得相應的曲線，樣品的HIF-1α含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度,。

3,、檢測值范圍：0-800pg/ml

4、敏感度： 1.0 pg/ml