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中級會(huì)員 | 第18年

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核酸提取,、PCR,、熒光定量PCR常見問題解答

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*部分 核酸DNA和RNA提取常見問題分析

1.       RNAfixer的工作原理?

浸入組織,,抑制RNase的活性,。運(yùn)輸方便,是非液氮類的一種樣品儲(chǔ)存液,。

2.       對于內(nèi)源RNase豐富的組織和樣品,,如何消除RNase?

可以在提取時(shí)候多加裂解液,,比如4:1等,。

3.       TRIpure and RNApure區(qū)別?

胍鹽類的裂解液一樣,,RNApure附加有離心柱,,和漂洗液,是Kit,。

TRIpure只是裂解液,。

4.       凝血的gDNA和RNA的提取與新鮮血的提取不同?

需加一個(gè)分離柱(separate column)分開凝血,。

5.       microRNA提取和定量,?

過2次離心柱,得到200bp一下的小RNA,??梢詼y定OD定量。

6.       血清,,血漿,,血液RNA提取的區(qū)別,?以及Viral RNA提取的方法?

液體類樣品RNA提取用TRIpure LS,。一般血清,、血漿是無細(xì)胞樣品,含游離的RNA,,量比較少,,建議加Carrier RNA在提取時(shí)候。

病毒RNA提取加Carrier RNA在提取時(shí)候,,BioTeke有專門的病毒RNA提取試劑盒,。

7.       通用植物RNA提取常見問題:蛋白質(zhì)污染?

DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)

8.       真菌RNA提取

可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit,。

9.       DNA cleanup from gel and PCR, 區(qū)別,?

膠回收含有一個(gè)溶膠液。多功能膠回收可以用于膠回收和PCR產(chǎn)物回收,。

10.    土壤DNA提取優(yōu)點(diǎn),?

無需要機(jī)械破碎樣品和過柱的純化方式,減少DNA的鍛煉和得率,,達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

 

第二部分PCR/RT-PCR常見問題解答

1.     二次PCR無目標(biāo)產(chǎn)物,,電泳孔道亮?

Template稀釋和重新設(shè)計(jì)引物

2.     microRNA的反轉(zhuǎn)錄問題,?

microRNA反轉(zhuǎn)錄和普通的mRNA的反轉(zhuǎn)錄不一樣?,F(xiàn)在常見的microRNA反轉(zhuǎn)錄引物有2種,一個(gè)是step-loop結(jié)構(gòu),;另外一種是3末端加polyA后,,再用oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit,。

3.     cDNA的合成(RT)電泳,,以及cDNA第二鏈的合成問題?

2-5uLcDNA產(chǎn)物電泳有模糊條帶出現(xiàn),。第二鏈合成也有專門的試劑盒,。BioTeke現(xiàn)在沒有此類產(chǎn)品。

4.     Power Mix擴(kuò)增不成功因素,?

產(chǎn)品或者引物或者目的基因的不表達(dá),。

5.     RT-PCR沒有擴(kuò)增產(chǎn)物?

可能是引物,模版,,產(chǎn)品等,。

 

 

第三部分Real-time qPCR 常見問題分析

1.     做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)候,可否用2個(gè)不同體系濃度的稀釋分別對于內(nèi)參和目的基因,?

建議用同樣稀釋倍數(shù)做曲線,,因?yàn)槟0鍧舛葧?huì)影響擴(kuò)增效率。

2.     熔解曲線中,,Tm不出現(xiàn)在80度左右,?

擴(kuò)增片段100bp左右的,一般應(yīng)該出現(xiàn)在80度左右,。如果低于此溫度出現(xiàn),,可能是模板降解。

3.     擴(kuò)增曲線沒有Ct值,,僅僅一條斜線,?什么原因?

模板濃度過低或者模板降解,。

4.     如果內(nèi)參和目標(biāo)基因表達(dá)量差別比較大,,也就是目的基因的表達(dá)量少,

   Ctcon=15,,Cttarget=38,,可否應(yīng)用?

可以用于數(shù)據(jù)分析,。因?yàn)楸磉_(dá)量低,,從而用過高模板進(jìn)行擴(kuò)增,從而同內(nèi)標(biāo)的模板不同,,反而會(huì)增大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的誤差,。

5.     引物濃度可否是50nM,是否太低,?

如果擴(kuò)增曲線和熔解曲線比較好,,這個(gè)濃度當(dāng)然可以。如果更低,,擴(kuò)增結(jié)果好的情況下,,同樣可以運(yùn)用。

一句話,,所有的模板,、引物等濃度盡量不要用高的,會(huì)影響擴(kuò)增效率,。

6.     miRNA多個(gè)擴(kuò)增時(shí)候,,如果一個(gè)的擴(kuò)增效果比較,其它熔解曲線不止一個(gè)峰,,如何解決,?

Primer對于miRNA是專一的。所以重新設(shè)計(jì)引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等,。反應(yīng)體系會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)物的,。

7.     相對定量方法,如果用Ct值比較,,是各個(gè)樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好,?

相對定量的方法各有優(yōu)缺點(diǎn),主要取決于實(shí)驗(yàn)的目的和材料的準(zhǔn)備,。如果是材料群體個(gè)體差異不大,,這2種方法基本沒有很大的區(qū)別;如果是個(gè)體差異比較大,,建議用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線做,。就是分別做內(nèi)參和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別帶入Ct值計(jì)算,。

8.     熔解程序可否不加,?

如果是擴(kuò)增效果好,特異擴(kuò)增,,可以不加熔解程序,;但建議做好加上。

9.     擴(kuò)增反應(yīng)體系5uL,,擴(kuò)增效率低,,什么原因?

反應(yīng)體系小,,各種因素的影響比較大,,比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會(huì)影響擴(kuò)增效率的,。

10.  如何減少非特異性擴(kuò)增的干擾,?

設(shè)計(jì)一對好引物,提高primer的退火溫度,,以及設(shè)定吸光溫度,。


 

 

 

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