液相色譜法測定谷物中黃曲霉毒素B1、G1,、B2,、G2含量
摘要用一種快速方便的真菌毒素多功能凈化柱處理樣品,然后用液相色譜對谷物中黃曲霉毒素B1、G1,、B2,、G2進行測定。樣品經(jīng)乙腈-水（體積比84：16）提取,，提取液通過真菌毒素多功能凈化柱凈化,、濃縮，三氟乙酸（TFA）柱前衍生,，C18色譜柱分離,，熒光檢測器檢測，外標法定量,。對添加兩個濃度黃曲霉毒素的玉米樣品進行加標回收實驗,，4種毒素的回收率均在90.44%～101.23%之間，B1,、G1,、B2、G2的zui低檢測限分別為2.0,、1.0,、0.5、0.5ng/kg,。實驗結(jié)果表明,，此法不僅定量準確,，精密度高而且操作極為方便,。
真菌毒素對糧食飼料的污染是一個性的問題，我國因是農(nóng)業(yè)大國和人民以谷物為主食的飲食習(xí)慣,，使真菌毒素的污染問題顯得更為突出,。黃曲霉毒素是真菌毒素的重要代表之一，對世界上30多個國家和地區(qū)進行的調(diào)查表明,，危害程度排在*位的是黃曲霉毒素,。它是由黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的化合物[1],，均為二呋喃香豆素（difuranocoumarin）的衍生物,。雖然黃典霉毒素（AF）的衍生物有20多種，目前已分離鑒定出的AF包括：AFB1,、AFB2,、AFG1、AFG2,、AFM1,、AFM2、AFP1,、AFQ、AFH1,、AFGM,、AFB2a和毒醇等12種，但天然污染糧油食品的AF是B組和G組兩大類,，即AFB1、AFB2,、AFG1和AFG2,。黃曲霉毒素的毒性，致突變及致癌作用已得到明確證實,。它由強到弱的順序依次為AFB1> AFG1>AFM1>AFB2>AFG2[2],。歐盟的黃曲霉毒素的*AFB1是4μg/kg。
霉菌毒素的檢測定量一直是個難點,，目前黃曲霉毒素檢測的國標方法有薄層色譜法,、酶聯(lián)免疫法、免疫親和柱凈化液相色譜法,。薄層色譜法操作繁瑣、污染大,、定量差,、耗時長,；而酶聯(lián)免疫法雖操作簡單,、靈敏度高，但特異性差,；免疫親和柱液相色譜法是柱后衍生法,，它對于高黃曲霉毒素含量的樣品偏差較大。且柱后衍生不普及,給使用帶來不便,。本文所述方法用真菌毒素多功能凈化柱快速凈化,，液相柱前衍生法簡單方便,，靈敏度和特異性高，又能避免氯仿等有毒試劑的使用,是一種值得推廣的好方法,。這種方法,，在上不少試驗室已得到確認，還被作為AOAC的*方法,。
1 材料與方法
1.1 試劑和儀器
乙腈（色譜純）,、甲醇（色譜純）、*（分析純）,、去離子水,、PuriToxSR160真菌毒素多功能凈化柱、液相色譜儀,、2475熒光檢測器,。
1.2 標準品的準備
標準品包括了黃曲霉毒素B1、G1,、B2,、G2各單一標準液和混合標準液，溶劑為乙腈,，黃曲霉素混合標準液的濃度為2μg/ml B1,、G1以及0.5μg/ml B2、G2,。單一標準液用來確定各自的保留時間,，具體工作用混合標準液是將所提供標準液稀釋10倍，用微量注射器分別取5.0,、10.0,、20.0、25.0,、40.0,、50.0μl稀釋標準液（具體濃度為200ng/ml的B1、G1,；50ng/ml的B2,、G2），和樣品一樣蒸干,，用三氟乙酸衍生,，定容于0.2ml流動相，故所得進針的濃度分別是：B1,、G1為5.0,、10.0、20.0,、25.0,、40.0,、50.0ng/ml；G2,、B2為1.25,、2.5、5.0,、6.25,、10.0、12.5ng/ml,。
1.3 樣品
實驗所用樣品包括玉米,、小麥等，取代表樣品5kg,，粉碎,，充分混合均勻，四分法縮至500g,。因霉菌毒素分布不均勻,，充分混合非常重要，必要時取樣量加大（有地方建議取15kg）,。
1.4 樣品的提取和凈化
使用粉碎機將樣品研細,，稱取25g研細樣品置于250ml的燒瓶或攪拌瓶中。加入100ml乙腈-水（體積比84：16）溶液,。在旋轉(zhuǎn)震蕩器上震蕩1h,。用漏斗、定性濾紙將其過濾到樣品瓶中,。轉(zhuǎn)移8ml樣品提取液通過PuriToxSR160真 菌毒素多功能凈化柱,，推出大約4ml的凈化液（具體過程見圖1），轉(zhuǎn)移2ml已凈化的提取液至潔凈的棕色瓶,。在水浴60℃條件下用氮氣吹干,。
1.5 柱前衍生及液相色譜條件
向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸,，立即旋緊蓋子,。渦旋30s，在40℃烘箱中衍生15min,，室溫下氮氣吹干混合物，用200μl水-乙腈（體積比85：15）溶解殘余物并渦旋30s,，將其轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心試管中以10 000r/min的速度離心5min,，把已經(jīng)制備凈化好的150μl樣品液轉(zhuǎn)移到HPLC樣品瓶，進樣25μl,。液相色譜條件見表1,。
2 結(jié)果與討論
2.1 4種黃曲霉毒素的分離情況
取50μl黃曲霉毒素混標工作溶液（濃度為B1,、G1 200ng/ml；G2,、B2 50ng/ml）于棕色瓶內(nèi),，吹干，衍生,，流動相定容,，經(jīng)液相色譜分離得出的標準色譜分離見圖2。黃曲霉毒素G1,、B1的濃度為50ng/mlG2,、B2的濃度為12.5ng/ml。
2.2 標準曲線及回歸方程
按實驗方法進行測定,，4種黃曲霉毒素的標準曲線,、回歸方程及檢出限（按3倍信噪比計算）的測定結(jié)果見圖3和表2。
2.3 樣品的加標回收實驗
取玉米樣品一份,，分別做兩個濃度的加標回收實驗,。具體做法是：取8ml黃曲霉素空白樣的提取液,分別加10μl和 25μl黃曲霉素混合標準液（1 000ng/ml黃曲霉素B1、G1以及250ng/ml黃曲霉素B2,、G2）作為加標,。經(jīng)過和樣品一樣的處理,得出其zui后的理論濃度見下式。
①B1,、G1濃度：（0.010ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=12.5ng/ml,；
（0.025ml×1 000ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=31.25ng/ml。
②B2,、G2濃渡：
（0.010ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=3.125ng/ml,；
（0.025ml×250ng/ml）/8ml×（2ml/0.2ml）=7.812 5ng/ml。
2.4 精密度實驗
按實驗方法進行樣品處理,，對同一樣品連續(xù)測定5次,。
2.5 樣品調(diào)查
從市面上抽取10份玉米樣品,按此實驗方法進行處理，結(jié)果為未檢出黃曲霉毒素,。此方法簡便易行,、快速準確、靈敏度高,、檢測限低,，適合大批量檢測，值得推廣,。
