彗星電泳法檢測細胞損傷ELISA試劑盒
彗星法 DNA 損傷檢測試劑盒
（ Comet Assay for DNA Damage Detection Kit）
Cat number：KGA For Research Use Only
Store at4℃ for one year
Expire date：
一,、試劑盒說明
DNA在自由基（如·OH）的攻擊下容易發(fā)生損傷,，即脫氧戊糖遭到破壞，磷酸二脂鍵的斷裂,，堿基的破壞或脫落,，便可進一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細胞固定于低熔點瓊脂糖中,，取少量細胞涂在載玻片上,，用堿高鹽溶液破壞細胞膜，再用堿溶液使DNA分子解旋,。將載玻片置于電泳液中,，在電場的作用下，DNA分子向陽極移動,。如果DNA損傷嚴重,，碎片多，則電泳速度快,。未受損傷的DNA大分子則由于細胞膜的阻隔,，滯留在原處,。用PI染色或銀染，可觀察到DNA受損的細胞形同彗星現(xiàn)象,，作定性分析,。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。
二,、試劑盒組份
組份
Cat: KGA240（20 assays）
儲存條件
Lysis Bufffer
100 mL
4℃
DMSO
8 mL
4℃
正常熔點瓊脂糖NMA
30 mg
4℃
低溶點瓊脂糖LMA
30 mg
4℃
Propidium Iodide （PI）
400μL
4℃避光
三,、 Kit以外自備儀器和試劑
低速離心機 、水平電泳儀,、熒光顯微鏡,、370C,、450C水浴,、載玻片、蓋玻片,、平皿,、微量移液器、1.5m L Microtube,、0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）緩沖液,、PBS
四、注意事項
Propidium Iodide （PI）和EB有毒,，操作時要戴手套,。
五、操作方法
1．細胞用冰冷的PBS洗一次,，離心收集,，用PBS重懸使其密度為1×106個/mL；
2．鋪膠： 下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制
第1層凝膠的制備：:將載玻片的磨砂面向上,，40℃預(yù)熱,，將預(yù)熱45℃的100μL的0.5%正常熔點瓊脂糖（NMA）鋪于載玻片上，蓋上干凈的蓋玻片,，再置4℃下10min使NMA凝固,。
第2層凝膠的制備：:將10μL細胞（約 104個）和75μL的0.7%低溶點瓊脂糖LMA（在37℃下水浴加熱至少20min使之*溶化）混合均勻。然后,，輕輕揭去蓋玻片,，ELISA試劑盒迅速將含細胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上，立即蓋上另一干凈蓋玻片,，置4℃10min使第2層LMA凝固,。
第3層凝膠的鋪制：:第2層LMA凝固后，在室溫下小心移去蓋玻片,，滴加預(yù)熱37℃的75μL的0.7%低溶點瓊脂糖LMA,，如上蓋上蓋玻片4℃下凝固（第三層覆蓋第二層周圍0.5mm,，增加凝膠化作用時間至30min，高濕度環(huán)境）,。
3．細胞裂解 移去蓋玻片,，將玻片置于平皿中,倒入預(yù)冷的Lysis Bufffer （使用前每9 mL加入1 mL的DMSO）， 4℃裂解1～2h,，取出載玻片用PBS漂洗,。
4．DNA堿解旋 將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液（用戶自備1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH）,，約覆過載玻片膠面0.25cm左右,，室溫放置20～60min，以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,，使DNA斷鏈在電場中易于遷移,。
5．單細胞電泳 在電壓25V，電泳20～30min,，電壓,、電流可用改變緩沖液面高低來調(diào)節(jié)。
6．中和與染色 電泳后將載玻片置于平皿內(nèi),。加入0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）緩沖液,，將載玻片沒入，4℃中和三次,，每次10min,，棄去Tris-HCl緩沖液，每載玻片加20μL的PI染液或EB染液,，蓋上蓋玻片,，避光染色10min。
7．觀察,、拍照和分析 熒光顯微鏡515～560nm波長的激發(fā)光,、PI染色的DNA圖象呈紅色，EB染色的DNA圖象呈桔紅色,，可清楚地觀察到核DNA和遷移的DNA（即慧星尾）,。每個樣本隨機選擇100個細胞，測定核DNA直徑和DNA遷移的長度,，可并用相應(yīng)的軟件分析,。DNA損傷按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級： 0級： ＜ 5% 無損傷；ELISA試劑盒 1級 5~20% 輕度損傷,；2級 20~40% 中度損傷,；3級 40~95% 高度損傷；4級 ＞95% 重度損傷