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彗星電泳法檢測細胞損傷ELISA試劑盒
彗星法 DNA 損傷檢測試劑盒
( Comet Assay for DNA Damage Detection Kit)
Cat number:KGA For Research Use Only
Store at4℃ for one year
Expire date:
一,、試劑盒說明
DNA在自由基(如·OH)的攻擊下容易發(fā)生損傷,即脫氧戊糖遭到破壞,,磷酸二脂鍵的斷裂,,堿基的破壞或脫落,便可進一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂,。將細胞固定于低熔點瓊脂糖中,,取少量細胞涂在載玻片上,用堿高鹽溶液破壞細胞膜,,再用堿溶液使DNA分子解旋,。將載玻片置于電泳液中,在電場的作用下,,DNA分子向陽極移動,。如果DNA損傷嚴重,碎片多,則電泳速度快,。未受損傷的DNA大分子則由于細胞膜的阻隔,,滯留在原處。用PI染色或銀染,,可觀察到DNA受損的細胞形同彗星現(xiàn)象,,作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析,。
二,、試劑盒組份
組份
Cat: KGA240(20 assays)
儲存條件
Lysis Bufffer
100 mL
4℃
DMSO
8 mL
4℃
正常熔點瓊脂糖NMA
30 mg
4℃
低溶點瓊脂糖LMA
30 mg
4℃
Propidium Iodide (PI)
400μL
4℃避光
三、 Kit以外自備儀器和試劑
低速離心機 ,、水平電泳儀,、熒光顯微鏡、370C,、450C水浴,、載玻片、蓋玻片,、平皿、微量移液器,、1.5m L Microtube,、0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液、PBS
四,、注意事項
Propidium Iodide (PI)和EB有毒,,操作時要戴手套。
五,、操作方法
1.細胞用冰冷的PBS洗一次,,離心收集,用PBS重懸使其密度為1×106個/mL,;
2.鋪膠: 下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制
第1層凝膠的制備::將載玻片的磨砂面向上,,40℃預(yù)熱,將預(yù)熱45℃的100μL的0.5%正常熔點瓊脂糖(NMA)鋪于載玻片上,,蓋上干凈的蓋玻片,,再置4℃下10min使NMA凝固。
第2層凝膠的制備::將10μL細胞(約 104個)和75μL的0.7%低溶點瓊脂糖LMA(在37℃下水浴加熱至少20min使之*溶化)混合均勻,。然后,,輕輕揭去蓋玻片,ELISA試劑盒迅速將含細胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上,,立即蓋上另一干凈蓋玻片,,置4℃10min使第2層LMA凝固。
第3層凝膠的鋪制::第2層LMA凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,,滴加預(yù)熱37℃的75μL的0.7%低溶點瓊脂糖LMA,,如上蓋上蓋玻片4℃下凝固(第三層覆蓋第二層周圍0.5mm,增加凝膠化作用時間至30min,,高濕度環(huán)境),。
3.細胞裂解 移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預(yù)冷的Lysis Bufffer (使用前每9 mL加入1 mL的DMSO),, 4℃裂解1~2h,,取出載玻片用PBS漂洗。
4.DNA堿解旋 將載玻片置于水平電泳槽,。倒入新配制的堿性電泳緩沖液(用戶自備1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),,約覆過載玻片膠面0.25cm左右,室溫放置20~60min,,以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段,,使DNA斷鏈在電場中易于遷移。
5.單細胞電泳 在電壓25V,,電泳20~30min,,電壓、電流可用改變緩沖液面高低來調(diào)節(jié),。
6.中和與染色 電泳后將載玻片置于平皿內(nèi),。加入0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)緩沖液,將載玻片沒入,,4℃中和三次,,每次10min,棄去Tris-HCl緩沖液,,每載玻片加20μL的PI染液或EB染液,,蓋上蓋玻片,避光染色10min,。
7.觀察,、拍照和分析 熒光顯微鏡515~560nm波長的激發(fā)光、PI染色的DNA圖象呈紅色,,EB染色的DNA圖象呈桔紅色,可清楚地觀察到核DNA和遷移的DNA(即慧星尾),。每個樣本隨機選擇100個細胞,,測定核DNA直徑和DNA遷移的長度,可并用相應(yīng)的軟件分析,。DNA損傷按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級: 0級: < 5% 無損傷,;ELISA試劑盒 1級 5~20% 輕度損傷,;2級 20~40% 中度損傷;3級 40~95% 高度損傷,;4級 >95% 重度損傷
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