在我們培養(yǎng)原代細(xì)胞的過(guò)程中,，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代是一項(xiàng)常規(guī)的操作,，傳代可以幫助我們擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時(shí)也避免了因細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期乃至衰亡期而大量死亡的窘境,。今天我們簡(jiǎn)單講講傳代操作（主要針對(duì)貼壁細(xì)胞）,。

實(shí)驗(yàn)原理：

當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，將會(huì)出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象,，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂速度逐漸減慢,，甚至停止。貼壁細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)成致密單層 (懸浮細(xì)胞會(huì)充滿整個(gè)體積的培養(yǎng)液),，鋪滿培養(yǎng)瓶底部,，此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng),，細(xì)胞將逐漸走向衰老,、死亡，將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng),，稱(chēng)為傳代培養(yǎng),。

首先，我們需要準(zhǔn)備好相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)器材：裝有75%醫(yī)用消毒酒精的酒精噴壺,、PBS緩沖液、胰酶,、含血清培養(yǎng)基,、巴氏吸管、移液器,、離心管,、廢液缸。至于其他的超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱,、離心機(jī)等都是一個(gè)細(xì)胞間的基礎(chǔ)設(shè)施,。

然后，我們需要把我們準(zhǔn)備的器材放入超凈臺(tái),，打開(kāi)紫外照射滅菌,，值得注意的是若是培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)溫度比較敏感，可以將含血清的培養(yǎng)基瓶子（包括盛放胰酶的瓶子）放入37℃的水浴箱使得培養(yǎng)基溫度在37℃,，再轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)紫外滅菌,，當(dāng)然一般的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的溫度不是很敏感，不用對(duì)培養(yǎng)基加溫也是可以的,。另外,，細(xì)胞培養(yǎng)間也需要紫外照射半小時(shí)左右。

操作步驟：

1,、紫外照射滅菌后,，我們應(yīng)該穿好滅菌服，戴好滅菌手套和口罩,。

2,、從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶（一般選擇處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞），用酒精噴壺在培養(yǎng)瓶表面噴灑75%酒精消毒,，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶到超凈臺(tái),。

3、打開(kāi)蓋子,，輕輕吸出舊的培養(yǎng)液,，用巴氏吸管加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次（注意從側(cè)壁加入，以免沖掉細(xì)胞）,，棄去PBS緩沖液,。

4、可用移液器加入1-2ml胰酶（具體量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定,，此處僅為參考用量）,，“十字"晃動(dòng)，使胰酶充分接觸細(xì)胞,。

5,、將加入胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺(tái)，鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，當(dāng)細(xì)胞變圓且大量脫落時(shí),，準(zhǔn)備終止消化，用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面,，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái),。

6,、用移液器（或巴氏吸管）加入等量含血清培養(yǎng)基，終止消化,。移液器（或巴氏吸管）充分吹打（動(dòng)作也不要太猛,，畢竟細(xì)胞也是蠻脆弱的），使細(xì)胞能夠脫落,。

7,、將培養(yǎng)瓶中混合液體轉(zhuǎn)移至離心管中（離心管規(guī)格根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定），配平,，離心5分鐘左右（離心機(jī)轉(zhuǎn)速根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)而定,，常見(jiàn)的有1000rpm/min）

8、離心好后,，用酒精噴壺噴灑離心管表面,，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺(tái)，打開(kāi)蓋子,，將上清液倒入廢液缸,。

9、加入適量體積含血清培養(yǎng)基,，用移液器或巴氏吸管輕輕吹打,，制成細(xì)胞懸液。

10,、將細(xì)胞懸液分裝進(jìn)2個(gè)（或多個(gè)）潔凈滅菌培養(yǎng)瓶,，加入適量培養(yǎng)基，蓋好蓋子

1,、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺(tái),，觀察細(xì)胞情況，細(xì)胞應(yīng)保證一定數(shù)量,，數(shù)量太少會(huì)影響生長(zhǎng)情況,。

12、在培養(yǎng)瓶上做標(biāo)記,，注明傳代時(shí)間,，細(xì)胞種類(lèi)，操作人員等信息,。在放入培養(yǎng)箱之前應(yīng)再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面,，然后應(yīng)記得整理操作臺(tái)，用75%酒精擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面,，清理廢液和垃圾,。

注意，全程嚴(yán)格無(wú)菌操作,！

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