在我們培養(yǎng)原代細(xì)胞的過程中，對細(xì)胞進(jìn)行傳代是一項(xiàng)常規(guī)的操作,，傳代可以幫助我們擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量,，同時(shí)也避免了因細(xì)胞進(jìn)入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境,。今天我們簡單講講傳代操作（主要針對貼壁細(xì)胞）,。

實(shí)驗(yàn)原理：

當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,，將會出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長和分裂速度逐漸減慢,，甚至停止,。貼壁細(xì)胞會在培養(yǎng)瓶中長成致密單層 (懸浮細(xì)胞會充滿整個(gè)體積的培養(yǎng)液)，鋪滿培養(yǎng)瓶底部,，此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng),，即傳代培養(yǎng),，細(xì)胞將逐漸走向衰老,、死亡，將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng),，稱為傳代培養(yǎng),。

首先，我們需要準(zhǔn)備好相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)器材：裝有75%醫(yī)用消毒酒精的酒精噴壺,、PBS緩沖液,、胰酶、含血清培養(yǎng)基,、巴氏吸管,、移液器、離心管,、廢液缸,。至于其他的超凈臺、培養(yǎng)箱,、離心機(jī)等都是一個(gè)細(xì)胞間的基礎(chǔ)設(shè)施,。

然后，我們需要把我們準(zhǔn)備的器材放入超凈臺,，打開紫外照射滅菌,，值得注意的是若是培養(yǎng)的細(xì)胞對溫度比較敏感,，可以將含血清的培養(yǎng)基瓶子（包括盛放胰酶的瓶子）放入37℃的水浴箱使得培養(yǎng)基溫度在37℃，再轉(zhuǎn)移到超凈臺紫外滅菌,，當(dāng)然一般的細(xì)胞對培養(yǎng)基的溫度不是很敏感,，不用對培養(yǎng)基加溫也是可以的。另外,，細(xì)胞培養(yǎng)間也需要紫外照射半小時(shí)左右,。

操作步驟：

1、紫外照射滅菌后,，我們應(yīng)該穿好滅菌服,，戴好滅菌手套和口罩。

2,、從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶（一般選擇處于對數(shù)期的細(xì)胞）,，用酒精噴壺在培養(yǎng)瓶表面噴灑75%酒精消毒，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶到超凈臺,。

3,、打開蓋子，輕輕吸出舊的培養(yǎng)液,，用巴氏吸管加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次（注意從側(cè)壁加入,，以免沖掉細(xì)胞），棄去PBS緩沖液,。

4,、可用移液器加入1-2ml胰酶（具體量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定，此處僅為參考用量）,，“十字"晃動,，使胰酶充分接觸細(xì)胞。

5,、將加入胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺,，鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓且大量脫落時(shí),，準(zhǔn)備終止消化,，用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面，轉(zhuǎn)移到超凈臺,。

6,、用移液器（或巴氏吸管）加入等量含血清培養(yǎng)基，終止消化,。移液器（或巴氏吸管）充分吹打（動作也不要太猛,，畢竟細(xì)胞也是蠻脆弱的），使細(xì)胞能夠脫落,。

7,、將培養(yǎng)瓶中混合液體轉(zhuǎn)移至離心管中（離心管規(guī)格根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定）,，配平，離心5分鐘左右（離心機(jī)轉(zhuǎn)速根據(jù)細(xì)胞種類而定,，常見的有1000rpm/min）

8,、離心好后，用酒精噴壺噴灑離心管表面,，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺,，打開蓋子，將上清液倒入廢液缸,。

9,、加入適量體積含血清培養(yǎng)基，用移液器或巴氏吸管輕輕吹打,，制成細(xì)胞懸液,。

10、將細(xì)胞懸液分裝進(jìn)2個(gè)（或多個(gè)）潔凈滅菌培養(yǎng)瓶,，加入適量培養(yǎng)基,，蓋好蓋子

1、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺,，觀察細(xì)胞情況,，細(xì)胞應(yīng)保證一定數(shù)量，數(shù)量太少會影響生長情況,。

12,、在培養(yǎng)瓶上做標(biāo)記，注明傳代時(shí)間,，細(xì)胞種類,，操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應(yīng)再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面,，然后應(yīng)記得整理操作臺，用75%酒精擦拭超凈臺臺面,，清理廢液和垃圾,。

注意，全程嚴(yán)格無菌操作,！

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