大鼠核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）ELISA試劑盒江西,，南昌

本試劑僅供研究使用  標(biāo)本：血清或血漿

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試驗(yàn)原理：

NF-κB試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知NF-κB濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測,。先將NF-κB和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育,。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A,、B,，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色,。顏色的深淺和樣品中NF-κB的濃度呈比例關(guān)系,。

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試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制

96/48人份酶標(biāo)板1塊板（96T）半塊板（48T）即用型

塑料膜板蓋1塊半塊即用型

標(biāo)準(zhǔn)品：8.0umol/L1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按說明書進(jìn)行稀稀

空白對照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型

生物素標(biāo)記的抗NF-κB抗體1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型

親和鏈酶素-HRP1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型

洗滌緩沖液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按說明書進(jìn)行稀釋

底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

終止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

自備材料

1．蒸餾水,。

2．加樣器：5ul,、10ul、50ul,、100ul,、200、500ul,、1000ul,。

3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1．避免直接接觸終止液和底物A,、B,。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗,。

2．實(shí)驗(yàn)中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品。

3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

操作注意事項(xiàng)

1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,，使用前恢復(fù)到室溫,。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存,。

2．實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,，密封保存，以免變質(zhì),。

3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用,。

4．使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A、B液時(shí),，避免使用帶金屬部分的加樣器,。

5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。

6．洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7．底物A應(yīng)揮發(fā),，避免長時(shí)間打開蓋子,。底物B對光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下,。避免用手接觸，有毒,。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值,。

8．加入試劑的順序應(yīng)一致,，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣,。

9．按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作,。

樣品收集,、處理及保存方法

1,、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。

2、血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測,。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4,、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,，避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

試劑的準(zhǔn)備

1．標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,，不能儲存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

8.0 umol/L（6號標(biāo)準(zhǔn)品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

4.0 umol/L（5號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.0 umol/L（4號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1.0 umol/L（3號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0.5 umol/L（2號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0.25 umol/L（1號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0 umol/L（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul,。

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟

1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。

3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí),。

4．甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘,。

6．甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次,。如果用洗板機(jī)洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘。避免光照,。

8．取出酶標(biāo)板,，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果,。

9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（umol/L）

A8.08.0樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

B4.04.0樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

C2.02.0樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

D1.01.0樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

E0.50.5樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

F0.250.25樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

G00樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

H樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

局限

6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果,。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990,。

2. 特異性：不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%,。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析

1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y）,，相應(yīng)的NF-κB標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線,，樣品的NF-κB含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,。

3,、檢測值范圍：0-8.0umol/L

4、敏感度： 0.01 umol/L