間接ELISA檢測鴨瘟病毒
①包被抗原的制備,。取種毒適量,，按2000u／ml加入雙抗,，接種12日齡番鴨胚，接種量o,，2ml／個,，放人溫箱內(nèi)孵化，逐日照胚,，連續(xù)培養(yǎng)5天,，收集接種后48—120h內(nèi)死亡，胚體有典型病變的鴨胚尿囊液,，8000r／min離心20min,，取上清液，加入等量飽和硫酸銨,，使其終濃度達50％飽和度,，用玻棒攪拌均勻，置4℃過夜,。次日把溶液混勻,，10000r／min4℃離心30rain，沉淀用StolpH 7,，4 PBS溶解,，裝入透析袋內(nèi)，用PBS透析,。磁力攪拌器攪拌90min后置4℃過夜,，期間換液4次。用10％BaCl2檢測透析液中有無SO42-,，直至檢測不出SO42-為止,。病毒液一20~C凍存?zhèn)溆谩Ｓ贸Ｒ?guī)方法處理SephadexG—200裝柱,，取硫酸銨粗提的病毒樣品加在柱床上面,，待病毒液全部進入柱床后用PBS洗脫，控制流速o．5mi／113．111,，收集20管,，每管5ml，722分光光度計測定各管的OD280和OD260值,，依據(jù)公式蛋白濃度（mg／rnl）＝1．45 OD280一0．74OD260。計算各管的蛋白濃度,，以蛋白濃度為縱坐標,，試管號為橫坐標，繪制洗脫曲線，并計算每管的OD280／OD260,，把比值大于1的各試管合并,，用60％PEG-6000濃縮后再測定其蛋白濃度，作為包被抗原,。
間接ELISA檢測鴨瘟病毒
②間接ELISA*反應(yīng)條件的選擇,。
酶標抗體*工作濃度測定 參照文獻的方法提取健康鴨血清IgG，透析除鹽,，再經(jīng)SephadexG—25柱進一步除鹽,，共收集lo管，于280nm波長處測各管的OD值,，繪制洗脫峰曲線,，取蛋白吸收峰高的幾管合并，分光光度計測其蛋白濃度,。以o．05mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液將鴨IgG稀釋至100bg／mi,，于酶標板的每孔中加入100／~L，置濕盒中4~C過夜,。取出反應(yīng)板,，洗液（PBS—T，含0．05％tween 20的PBS洗滌3～5遍,，拍干,。加封閉液（含0．5％BSA的PBS-T），100iLL／孔,，室溫作用2L,，洗滌3—5遍，拍干,。以稀釋液（含0,，1％BSA的PBS-T）將酶標抗體作1：100、l：200,、1：400,、l；800等一系列稀釋,，依次加入各小孔中,，每個稀釋度加兩孔，每孔100t~L,，室溫作用5h,，洗滌。加底物溶液（OPI~Hz02,，室溫避光20min,，加入2mol／L H2SO：終止反應(yīng),，50t~L／{L。490nm波長下測OD值,，以能產(chǎn)生光密度為1．o的稀釋度為酶標抗體的zui適濃度,。間接ELISA檢測鴨瘟病毒
抗原和血清*稀釋度的選擇 采用方陣滴定法確定抗原和血清的*工作濃度用0．05mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液將抗原作1：10、1,；20,、1：40、1：80,、l：160,、1：320稀釋，分別加入到酶標板的第1列至第12列,，每個稀釋度加兩孔,，每孔100／mL，37~C作用1h,，轉(zhuǎn)入4~C過夜,；次日洗滌后封閉，再洗滌,；用含o．1％BSA的PBS—T將陰,、陽血清作1：20、㈠40,、1：80,、1：60稀釋，陽性血清的4個稀釋度依次加入到酶標板的1行,、3行,、5行、7行,，陰性血清的4個稀釋度依次加入到酶標板的2行,、4行、6行,、8行,，每孔1001LL，置濕盒內(nèi)37~C作用1h,，再洗滌,；加人1：400工作濃度的酶標抗體，37℃1h,，洗滌,；加底物溶液，室溫閉光30min,；加終止液,，490nm測其OD值,。以尸／Nzui大者所對應(yīng)的抗原和血清稀釋度作為抗原*包被濃度和血清*工作濃度。
ELISA反應(yīng)溫度和間隔時間的選擇 a,，抗原吸附時間和溫度：抗原包被后分別以37~C 1h轉(zhuǎn)入4~C過夜和直接37~C 5h吸附，對8份血清進行間接ELISA檢測,，測定OD值,。b．封閉液封閉時間和溫度、血清反應(yīng)時間和溫度,、酶標抗體工作時間和溫度的確定均選擇37~C 1h,，37~C 2h、室溫2h三種條件,，對4份效價較高的血清樣品進行ELISA檢測,，比較它們的OD值差異。c底物zui適作用時間的確定：以zui適稀釋度抗原,、血清和酶標抗體進行試驗,，加入底物后分別在室溫10min、20min,、30rain終止反應(yīng),，比較其OD值差異。陰陽性血清臨界值的確定 采集從1日齡飼養(yǎng)至28天,，未作任何疫苗免疫的健康鴨血清30份,，分別與等量鴨胚液混合，室溫作用2L,，高速離心,，取上清液作為陰性血清。測定30份血清的OD值,，以O(shè)D平均值加上3個標準差作為判定臨界值,，受檢血清高于此值即判為陽性。

③間接EIASA操作程序a．以zui適濃度的抗原包被反應(yīng)板,，100rtl／孔,，37~C 1h轉(zhuǎn)人4~C過夜，次日洗板3—5次,，每次5min,，拍干。b．以含O．5％BSA的PBS—T封閉,，37~Clh,，洗板3—5次。c．加入zui適稀釋度的待檢血清,，37~C 1h,，洗板,。d．加入zui適工作濃度的酶標抗體，37~C 1h,，洗板,。e．加入底物，室溫避光30min,。f．加入終止液,，50ul/孔 g．490nm波長下測OD值。