酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)C1q測定法

1 原理包被于塑料板上的固相凝聚IgG與酶聯(lián)C1q的結(jié)合受標(biāo)本中免疫復(fù)合物的抑制,，是一種競爭性抑制試驗(yàn),。為避免標(biāo)本中內(nèi)源C1q的干擾，應(yīng)預(yù)先用IgG免疫吸附劑將其除去,。

2 材料
（1） 聚苯乙烯反應(yīng)板,，酶聯(lián)免疫檢測儀。
（2） 免疫吸附劑系結(jié)合有IgG的纖維素,。取纖維素（5%,，pH值105）與溴化氰一起室溫反應(yīng)10min，用01mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH值80）充分洗滌,。再與IgG一起于4℃下作用18h（20ml緩沖液中含3g纖維素和100mg IgG）,。制備物用27mol/L甘氨酸緩沖液（pH值80）配成20%（W/V）懸液，貯于4℃,。
（3） 酶聯(lián)C1q用戊二醛法將辣根過氧化物酶標(biāo)記C1q,，再經(jīng)超濾AmiconXM200濾膜）分離貯于－20℃。
（4） 其他試劑002mol/L TrisHCl緩沖液（pH值90）,；02mol/L TrisHCl緩沖液（pH
值7.4）,，以及含005%Tween20的同一緩沖液；02mol/L EDTA （pH值76）,；酶底物溶液和中止液,。

3 方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)C1q測定法
（1） 包被凝聚IgG取經(jīng)002mol/L TrisHCl緩沖液（pH值90）透析過夜的凝聚IgG（100μg/ml），加入聚苯乙烯板孔內(nèi),，每孔100μl,，37℃包被30min后，用緩沖液洗3次（第1次,、第3次用02mol/L TrisHCl緩沖液（pH值74）,；第2次用含005% Tween20的同一緩沖液） ,真空干燥，貯于4℃,。
（2） 取血清標(biāo)本50μl,，加入02mol/L EDTA（pH值76）50μl，室溫作用10min,，使內(nèi)源C1 q游離,，然后加入IgG免疫吸附劑500μl，室溫振蕩20min,，再以500r/min離心5min,，得到1∶10稀釋的上清液,。
（3） 取已包被凝聚IgG的塑料反應(yīng)板，每孔中加入上述上清液90μl,，酶聯(lián)C1q10μl（1∶100 ～200稀釋液）,，室溫下反應(yīng)20min，然后用含02mol/L NaCl,，005%Tween20的02mol/L TrisHCl緩沖液（pH值74）洗3次,，再加入100μl底物溶液（pH值60、01mol/L磷酸鹽枸櫞酸鹽緩沖液50ml中,，加入鄰苯二胺20mg,，30%（W/V）過氧化氫10μl），室溫放30min,，加入2mol/L硫酸50μl中止反應(yīng),，于492nm讀取吸光值。如果定量,，可用凝聚IgG制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，測出免疫復(fù)合物的相對含量。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)C1q測定法