1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈,，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手,。

2. 將所需的培養(yǎng)基,，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈,，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后,，再將瓶口對準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋,，分別放于酒精燈的兩側(cè),。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對準(zhǔn)酒精燈,，且放在距離酒精燈zui近的位置,，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。

3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次,，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次,，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口,，豎直放好,。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液,，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi),。

4.  將培養(yǎng)使胰酶浸沒整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s,，立馬豎起對著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙,，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化的zui適時(shí)機(jī),。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度,；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，則需繼續(xù)消化,，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細(xì)胞層1s后迅速豎起對著燈光觀察細(xì)胞情況,，可反復(fù)幾次，直至出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個(gè)細(xì)胞脫落的消化狀態(tài),。用移液器將胰酶吸凈,。

5. 吸取1ml細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)瓶內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次,，使貼壁細(xì)胞*脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次,，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。

6. 將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi),，擰緊瓶蓋,，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記,。

7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈,，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面,，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái),。

8. 將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜,，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，zui后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長期保存,。

   注此過程也可簡化因?qū)嶋H操作過程中經(jīng)驗(yàn)所得：步驟7結(jié)束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內(nèi)4-5天,，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細(xì)胞株2-3月,。