在ELISA試劑盒中一般有3次加樣步聚,，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物,，加底物,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡,。 加標(biāo)本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成,。
可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛,，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液,、糞便）等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份,。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定（如血清,、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）,。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清,。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固后即可取得。除特殊情況外,，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本,。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血,，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色,。
ELISA試劑盒血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過(guò)久,，其中的可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA試劑盒中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái),，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃,，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩,，避免氣泡,，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩,?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè),。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落,，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作,，也可加入適當(dāng)防腐劑,。