冷凍斷裂與冷凍蝕刻基礎(chǔ)介紹

時(shí)間：2023-4-24 閱讀：941

揭示生物學(xué)樣本和材料樣本原本無(wú)法觀察到的內(nèi)部結(jié)構(gòu)

冷凍斷裂是一種將冰凍樣本劈裂以露出其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù),。冷凍蝕刻是指讓樣本表面的冰在真空中升華,，以便露出原本無(wú)法觀察到的斷裂面細(xì)節(jié)。金屬/碳復(fù)合鍍膜能夠?qū)崿F(xiàn)樣本在SEM（塊面）或TEM（復(fù)型）中的成像,，主要用于研究如細(xì)胞器,、細(xì)胞膜，細(xì)胞層和乳膠,。這項(xiàng)技術(shù)傳統(tǒng)上用于生物學(xué)應(yīng)用,，但現(xiàn)在逐漸在物理學(xué)和材料科學(xué)中展現(xiàn)出重要意義,。近年來(lái),，研究人員通過(guò)冷凍斷裂電子顯微鏡，尤其是冷凍復(fù)型免疫標(biāo)記（FRIL）,，對(duì)膜蛋白在動(dòng)態(tài)細(xì)胞過(guò)程中所發(fā)揮的作用有了新的見(jiàn)解,。

作者：Gisela H?flinger

圖1：麥葉上的蚜蟲(chóng)

適合于電子顯微鏡的環(huán)境

電子顯微鏡的樣品室通過(guò)抽真空處理降*低壓力。置于這種環(huán)境下的活細(xì)胞無(wú)法有效保全結(jié)構(gòu),，因?yàn)榧?xì)胞構(gòu)成中的大部分水分會(huì)快速蒸發(fā),。

生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被（固定）保存,，這樣后續(xù)脫水對(duì)原位結(jié)構(gòu)的破壞小,，同時(shí)可以使用環(huán)境掃描電鏡（SEM）或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態(tài)下含水結(jié)構(gòu)的方法,。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰（從水變?yōu)榱呅伪鶗r(shí)體積會(huì)增加）而是無(wú)定形冰,，因此體積保持不變。所以,，對(duì)滲透和溫度變化敏感的結(jié)構(gòu)得以保留（見(jiàn)文章“高壓冷凍基礎(chǔ)介紹"）,。

要觀察諸如細(xì)胞器、細(xì)胞膜,、乳膠或液體的表面界面等結(jié)構(gòu),，冷凍斷裂是一種方法。通過(guò)刀片（或類(lèi)似物）或釋放彈簧負(fù)載的外力來(lái)破開(kāi)冷凍樣本,，并沿著小阻力線斷裂樣本,。

圖2：冷凍斷裂

水的升華與凝結(jié) – 冷凍蝕刻與污染

要暴露冷凍斷裂面,，需要把冰去除。這就需要通過(guò)把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結(jié)構(gòu),。升華的過(guò)程是冰不經(jīng)過(guò)液態(tài)過(guò)程直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài),。而液態(tài)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致樣品體積和結(jié)構(gòu)的破壞。

圖3：ES,，細(xì)胞外表面,；PF，細(xì)胞膜冷凍斷裂面,；EF,，細(xì)胞膜外層冷凍斷裂面；FS,，細(xì)胞膜內(nèi)表面,；Cyt，細(xì)胞質(zhì)

水的升華/冷凝過(guò)程取決于特定溫度下的飽和壓力,，以及水或冰在室內(nèi)的有效水分壓,。

注意：良好的真空度會(huì)降低水分壓。

例如：溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar,。如果樣品室內(nèi)達(dá)到這個(gè)壓力,，則冷凝和蒸發(fā)處于平衡狀態(tài)。蒸發(fā)的分子數(shù)量等于冷凝的分子數(shù)量,。在更高壓力下,，冷凝速度要快于升華速度 – 因此冰晶會(huì)在樣本表面上生長(zhǎng)。必須采取一切手段來(lái)避免這種情況,。樣本上方一個(gè)較冷（比樣本更冷）的冷阱會(huì)降低局部壓力,，從而起到了冷凝阱的作用。從樣本中帶出的水分子優(yōu)先附著在較冷的表面上,。在低于飽和壓力的壓力下,，更多的分子升華而不是冷凝，同時(shí)會(huì)發(fā)生冷凍蝕刻,。

執(zhí)行冷凍蝕刻直到樣本*無(wú)冰,，這一過(guò)程稱為冷凍干燥。僅適用于合理時(shí)間內(nèi)執(zhí)行的小樣本,。該過(guò)程分為幾個(gè)步驟,，需要從大約-120℃加熱到-60℃，同時(shí)在每個(gè)步驟上使溫度保持一定時(shí)間,。該過(guò)程需要幾天的時(shí)間來(lái)完成,。

圖4：飽和蒸汽壓力（感謝Umrath 1982提供的圖片）

樣本溫度低于-120℃時(shí)，蝕刻速度非常慢，蝕刻持續(xù)時(shí)間會(huì)增加到不切實(shí)際的程度,。如果真空室的壓力固定,，則可以通過(guò)提高樣本溫度來(lái)提高蝕刻速度。對(duì)于生物樣本,，要特別小心溫度高于-90℃,。蝕刻速度會(huì)大幅提高。另外,，要注意玻璃態(tài)冰中形成六邊形冰晶從而導(dǎo)致脫水偽像,。

純水的理論升華速度會(huì)降低，因?yàn)椋?/div>

樣本深處的水升華速度比表面的水更慢,。
鹽和大分子溶劑會(huì)降低升華速度,。
生物樣本中大量存在的結(jié)合水會(huì)降低升華速度。

通過(guò)冷凍斷裂生成圖像

冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術(shù)往往采用高真空精細(xì)鍍膜技術(shù),，將超細(xì)膩重金屬和碳薄膜沉積于斷裂表面,。

冷凍斷裂樣本在一定角度下用金屬覆蓋，然后在碳背襯膜（徠卡EM ACE600冷凍斷裂或徠卡EM ACE900與徠卡EM VCT500）上生成復(fù)型進(jìn)行TEM成像或在SEM的試塊面上進(jìn)行成像,。

對(duì)于這兩種方法,，冷凍斷裂表面經(jīng)過(guò)一定的蝕刻時(shí)間后以相同的方式進(jìn)行鍍膜。首先在一定角度下進(jìn)行一層薄的（2-7nm）重金屬鍍膜,，以形成地形對(duì)比度（陰影）,。其次再針對(duì)重金屬薄膜，在90°下進(jìn)行一層厚的碳層（15-20nm）鍍膜,，以穩(wěn)定超薄電子束蒸發(fā),。此時(shí)的蝕刻處理會(huì)停止,。要對(duì)極小的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像,，需要在極低的角度（2–8°）鍍膜重金屬并在鍍膜期間旋轉(zhuǎn)樣本。這樣可增加細(xì)絲狀及其它細(xì)小結(jié)構(gòu)的對(duì)比度,。此項(xiàng)技術(shù)又稱為小角度旋轉(zhuǎn)投影,。

蒸鍍重金屬薄膜需要采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)。這種鍍膜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)精細(xì)定向沉積,。碳的支撐層穩(wěn)定了未被金屬覆蓋的結(jié)構(gòu),。隨著溫度的升高，這些結(jié)構(gòu)會(huì)改變它們的輪廓,，樣本不會(huì)*導(dǎo)電,，復(fù)型也不會(huì)粘在一起。

冷凍斷裂酵母的單向投影

圖5：低溫SEM,，BSE（背散射電子）圖像,。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM。J Microsc. 179, 229-237,。

圖6：復(fù)型,，TEM圖像（感謝Electronmicroscopy ETH Zürich提供圖片）,。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM。J Microsc. 179, 229-237,。

圖7：徠卡高壓冷凍,，真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統(tǒng)中，利用電子束發(fā)射槍和旋轉(zhuǎn)樣本底座來(lái)進(jìn)行冷凍蝕刻和低溫鍍膜,。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM,。油/水基樣品，–100℃（升華）3分鐘暴露油脂結(jié)構(gòu),。

圖8：徠卡高壓冷凍,，真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統(tǒng)中，利用電子束發(fā)射槍和旋轉(zhuǎn)樣本底座來(lái)進(jìn)行冷凍蝕刻和低溫鍍膜,。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM,。原生生物游仆蟲(chóng)混合培養(yǎng)的羽紋硅藻。感謝英國(guó)波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供圖片