會(huì)員.png)
16
當(dāng)前位置：河南榮程聯(lián)合科技有限公司>>技術(shù)文章>>冷凍斷裂與冷凍蝕刻基礎(chǔ)介紹
冷凍斷裂與冷凍蝕刻基礎(chǔ)介紹
揭示生物學(xué)樣本和材料樣本原本無法觀察到的內(nèi)部結(jié)構(gòu)
冷凍斷裂是一種將冰凍樣本劈裂以露出其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù)。冷凍蝕刻是指讓樣本表面的冰在真空中升華,，以便露出原本無法觀察到的斷裂面細(xì)節(jié),。金屬/碳復(fù)合鍍膜能夠?qū)崿F(xiàn)樣本在SEM（塊面）或TEM（復(fù)型）中的成像，主要用于研究如細(xì)胞器,、細(xì)胞膜,，細(xì)胞層和乳膠。這項(xiàng)技術(shù)傳統(tǒng)上用于生物學(xué)應(yīng)用,，但現(xiàn)在逐漸在物理學(xué)和材料科學(xué)中展現(xiàn)出重要意義,。近年來，研究人員通過冷凍斷裂電子顯微鏡,，尤其是冷凍復(fù)型免疫標(biāo)記（FRIL）,，對(duì)膜蛋白在動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程中所發(fā)揮的作用有了新的見解。
作者：Gisela H?flinger
圖1：麥葉上的蚜蟲
適合于電子顯微鏡的環(huán)境
電子顯微鏡的樣品室通過抽真空處理降*低壓力,。置于這種環(huán)境下的活細(xì)胞無法有效保全結(jié)構(gòu),，因?yàn)榧?xì)胞構(gòu)成中的大部分水分會(huì)快速蒸發(fā),。
生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被（固定）保存,，這樣后續(xù)脫水對(duì)原位結(jié)構(gòu)的破壞小,，同時(shí)可以使用環(huán)境掃描電鏡（SEM）或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態(tài)下含水結(jié)構(gòu)的方法,。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰（從水變?yōu)榱呅伪鶗r(shí)體積會(huì)增加）而是無定形冰,，因此體積保持不變。所以,，對(duì)滲透和溫度變化敏感的結(jié)構(gòu)得以保留（見文章“高壓冷凍基礎(chǔ)介紹"）,。
要觀察諸如細(xì)胞器、細(xì)胞膜,、乳膠或液體的表面界面等結(jié)構(gòu),，冷凍斷裂是一種方法。通過刀片（或類似物）或釋放彈簧負(fù)載的外力來破開冷凍樣本,，并沿著小阻力線斷裂樣本,。
電子顯微鏡的樣品室通過抽真空處理降*低壓力,。置于這種環(huán)境下的活細(xì)胞無法有效保全結(jié)構(gòu),，因?yàn)榧?xì)胞構(gòu)成中的大部分水分會(huì)快速蒸發(fā),。
生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被（固定）保存,，這樣后續(xù)脫水對(duì)原位結(jié)構(gòu)的破壞小,，同時(shí)可以使用環(huán)境掃描電鏡（SEM）或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態(tài)下含水結(jié)構(gòu)的方法,。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰（從水變?yōu)榱呅伪鶗r(shí)體積會(huì)增加）而是無定形冰,，因此體積保持不變。所以,，對(duì)滲透和溫度變化敏感的結(jié)構(gòu)得以保留（見文章“高壓冷凍基礎(chǔ)介紹"）,。
要觀察諸如細(xì)胞器、細(xì)胞膜,、乳膠或液體的表面界面等結(jié)構(gòu),，冷凍斷裂是一種方法。通過刀片（或類似物）或釋放彈簧負(fù)載的外力來破開冷凍樣本,，并沿著小阻力線斷裂樣本,。
圖2：冷凍斷裂
水的升華與凝結(jié) – 冷凍蝕刻與污染
要暴露冷凍斷裂面，需要把冰去除,。這就需要通過把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結(jié)構(gòu),。升華的過程是冰不經(jīng)過液態(tài)過程直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)。而液態(tài)過程會(huì)導(dǎo)致樣品體積和結(jié)構(gòu)的破壞,。
要暴露冷凍斷裂面，需要把冰去除,。這就需要通過把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結(jié)構(gòu),。升華的過程是冰不經(jīng)過液態(tài)過程直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)。而液態(tài)過程會(huì)導(dǎo)致樣品體積和結(jié)構(gòu)的破壞,。
圖3：ES,，細(xì)胞外表面；PF,，細(xì)胞膜冷凍斷裂面,；EF，細(xì)胞膜外層冷凍斷裂面,；FS,，細(xì)胞膜內(nèi)表面,；Cyt,，細(xì)胞質(zhì)
水的升華/冷凝過程取決于特定溫度下的飽和壓力，以及水或冰在室內(nèi)的有效水分壓,。
注意：良好的真空度會(huì)降低水分壓,。
例如：溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar。如果樣品室內(nèi)達(dá)到這個(gè)壓力,，則冷凝和蒸發(fā)處于平衡狀態(tài),。蒸發(fā)的分子數(shù)量等于冷凝的分子數(shù)量。在更高壓力下,，冷凝速度要快于升華速度 – 因此冰晶會(huì)在樣本表面上生長,。必須采取一切手段來避免這種情況,。樣本上方一個(gè)較冷（比樣本更冷）的冷阱會(huì)降低局部壓力，從而起到了冷凝阱的作用,。從樣本中帶出的水分子優(yōu)先附著在較冷的表面上,。在低于飽和壓力的壓力下，更多的分子升華而不是冷凝,，同時(shí)會(huì)發(fā)生冷凍蝕刻,。
執(zhí)行冷凍蝕刻直到樣本*無冰，這一過程稱為冷凍干燥,。僅適用于合理時(shí)間內(nèi)執(zhí)行的小樣本,。該過程分為幾個(gè)步驟，需要從大約-120℃加熱到-60℃,，同時(shí)在每個(gè)步驟上使溫度保持一定時(shí)間,。該過程需要幾天的時(shí)間來完成。
注意：良好的真空度會(huì)降低水分壓,。
例如：溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar。如果樣品室內(nèi)達(dá)到這個(gè)壓力,，則冷凝和蒸發(fā)處于平衡狀態(tài),。蒸發(fā)的分子數(shù)量等于冷凝的分子數(shù)量。在更高壓力下,，冷凝速度要快于升華速度 – 因此冰晶會(huì)在樣本表面上生長,。必須采取一切手段來避免這種情況,。樣本上方一個(gè)較冷（比樣本更冷）的冷阱會(huì)降低局部壓力，從而起到了冷凝阱的作用,。從樣本中帶出的水分子優(yōu)先附著在較冷的表面上,。在低于飽和壓力的壓力下，更多的分子升華而不是冷凝,，同時(shí)會(huì)發(fā)生冷凍蝕刻,。
執(zhí)行冷凍蝕刻直到樣本*無冰，這一過程稱為冷凍干燥,。僅適用于合理時(shí)間內(nèi)執(zhí)行的小樣本,。該過程分為幾個(gè)步驟，需要從大約-120℃加熱到-60℃,，同時(shí)在每個(gè)步驟上使溫度保持一定時(shí)間,。該過程需要幾天的時(shí)間來完成。
圖4：飽和蒸汽壓力（感謝Umrath 1982提供的圖片）
樣本溫度低于-120℃時(shí),，蝕刻速度非常慢,，蝕刻持續(xù)時(shí)間會(huì)增加到不切實(shí)際的程度。如果真空室的壓力固定,，則可以通過提高樣本溫度來提高蝕刻速度,。對(duì)于生物樣本，要特別小心溫度高于-90℃,。蝕刻速度會(huì)大幅提高,。另外，要注意玻璃態(tài)冰中形成六邊形冰晶從而導(dǎo)致脫水偽像,。
純水的理論升華速度會(huì)降低,，因?yàn)椋?/div>
冷凍斷裂樣本在一定角度下用金屬覆蓋,，然后在碳背襯膜（徠卡EM ACE600冷凍斷裂或徠卡EM ACE900與徠卡EM VCT500）上生成復(fù)型進(jìn)行TEM成像或在SEM的試塊面上進(jìn)行成像。
對(duì)于這兩種方法,，冷凍斷裂表面經(jīng)過一定的蝕刻時(shí)間后以相同的方式進(jìn)行鍍膜,。首先在一定角度下進(jìn)行一層薄的（2-7nm）重金屬鍍膜，以形成地形對(duì)比度（陰影）,。其次再針對(duì)重金屬薄膜,，在90°下進(jìn)行一層厚的碳層（15-20nm）鍍膜，以穩(wěn)定超薄電子束蒸發(fā),。此時(shí)的蝕刻處理會(huì)停止,。要對(duì)極小的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像,，需要在極低的角度（2–8°）鍍膜重金屬并在鍍膜期間旋轉(zhuǎn)樣本。這樣可增加細(xì)絲狀及其它細(xì)小結(jié)構(gòu)的對(duì)比度,。此項(xiàng)技術(shù)又稱為小角度旋轉(zhuǎn)投影,。
蒸鍍重金屬薄膜需要采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)。這種鍍膜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)精細(xì)定向沉積,。碳的支撐層穩(wěn)定了未被金屬覆蓋的結(jié)構(gòu),。隨著溫度的升高，這些結(jié)構(gòu)會(huì)改變它們的輪廓,，樣本不會(huì)*導(dǎo)電,，復(fù)型也不會(huì)粘在一起。 
圖5：低溫SEM,，BSE（背散射電子）圖像,。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM。J Microsc. 179, 229-237,。
圖6：復(fù)型,，TEM圖像（感謝Electronmicroscopy ETH Zürich提供圖片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM,。J Microsc. 179, 229-237,。
圖7：徠卡高壓冷凍，真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統(tǒng)中,，利用電子束發(fā)射槍和旋轉(zhuǎn)樣本底座來進(jìn)行冷凍蝕刻和低溫鍍膜,。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM。油/水基樣品,，–100℃（升華）3分鐘暴露油脂結(jié)構(gòu),。
樣本深處的水升華速度比表面的水更慢。
鹽和大分子溶劑會(huì)降低升華速度,。
生物樣本中大量存在的結(jié)合水會(huì)降低升華速度,。
通過冷凍斷裂生成圖像
冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術(shù)往往采用高真空精細(xì)鍍膜技術(shù)，將超細(xì)膩重金屬和碳薄膜沉積于斷裂表面,。
冷凍斷裂樣本在一定角度下用金屬覆蓋,，然后在碳背襯膜（徠卡EM ACE600冷凍斷裂或徠卡EM ACE900與徠卡EM VCT500）上生成復(fù)型進(jìn)行TEM成像或在SEM的試塊面上進(jìn)行成像。
對(duì)于這兩種方法,，冷凍斷裂表面經(jīng)過一定的蝕刻時(shí)間后以相同的方式進(jìn)行鍍膜,。首先在一定角度下進(jìn)行一層薄的（2-7nm）重金屬鍍膜，以形成地形對(duì)比度（陰影）,。其次再針對(duì)重金屬薄膜,，在90°下進(jìn)行一層厚的碳層（15-20nm）鍍膜，以穩(wěn)定超薄電子束蒸發(fā),。此時(shí)的蝕刻處理會(huì)停止,。要對(duì)極小的結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像,，需要在極低的角度（2–8°）鍍膜重金屬并在鍍膜期間旋轉(zhuǎn)樣本。這樣可增加細(xì)絲狀及其它細(xì)小結(jié)構(gòu)的對(duì)比度,。此項(xiàng)技術(shù)又稱為小角度旋轉(zhuǎn)投影,。
蒸鍍重金屬薄膜需要采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)。這種鍍膜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)精細(xì)定向沉積,。碳的支撐層穩(wěn)定了未被金屬覆蓋的結(jié)構(gòu),。隨著溫度的升高，這些結(jié)構(gòu)會(huì)改變它們的輪廓,，樣本不會(huì)*導(dǎo)電,，復(fù)型也不會(huì)粘在一起。
冷凍斷裂酵母的單向投影
圖5：低溫SEM,，BSE（背散射電子）圖像,。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM。J Microsc. 179, 229-237,。
圖6：復(fù)型,，TEM圖像（感謝Electronmicroscopy ETH Zürich提供圖片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）雙層鍍膜獲取高分辨率低溫SEM,。J Microsc. 179, 229-237,。
圖7：徠卡高壓冷凍，真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統(tǒng)中,，利用電子束發(fā)射槍和旋轉(zhuǎn)樣本底座來進(jìn)行冷凍蝕刻和低溫鍍膜,。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM。油/水基樣品,，–100℃（升華）3分鐘暴露油脂結(jié)構(gòu),。
圖8：徠卡高壓冷凍，真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統(tǒng)中,，利用電子束發(fā)射槍和旋轉(zhuǎn)樣本底座來進(jìn)行冷凍蝕刻和低溫鍍膜,。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM。原生生物游仆蟲混合培養(yǎng)的羽紋硅藻,。感謝英國波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供圖片
圖9：徠卡冷凍斷裂系統(tǒng)及徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM的HPF,、冷凍斷裂、冷凍蝕刻和低溫鍍膜,。油/水基乳液破裂,，露出洋蔥狀薄片結(jié)構(gòu),，形成液滴,。感謝漢堡拜爾斯多夫Stefan Wiesner博士提供的圖片。
圖10：TEM中的酵母細(xì)胞復(fù)型,。經(jīng)徠卡高壓冷凍和徠卡冷凍斷裂復(fù)型制備,。感謝Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的圖片,。
圖11：大麥葉上的真菌。安裝于徠卡冷凍斷裂儀樣本臺(tái)上,，并通過冷卻樣本臺(tái)在液氮下進(jìn)行冷凍,。徠卡冷凍斷裂儀對(duì)樣品進(jìn)行部分冷凍干燥（在更高的樣本溫度下冷凍干燥）。使用鎢鍍膜,。徠卡真空冷凍傳輸至低溫FESEM 5keV,。
圖9：徠卡冷凍斷裂系統(tǒng)及徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM的HPF,、冷凍斷裂、冷凍蝕刻和低溫鍍膜,。油/水基乳液破裂,，露出洋蔥狀薄片結(jié)構(gòu),，形成液滴,。感謝漢堡拜爾斯多夫Stefan Wiesner博士提供的圖片。
圖10：TEM中的酵母細(xì)胞復(fù)型,。經(jīng)徠卡高壓冷凍和徠卡冷凍斷裂復(fù)型制備,。感謝Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的圖片,。
圖11：大麥葉上的真菌。安裝于徠卡冷凍斷裂儀樣本臺(tái)上,，并通過冷卻樣本臺(tái)在液氮下進(jìn)行冷凍,。徠卡冷凍斷裂儀對(duì)樣品進(jìn)行部分冷凍干燥（在更高的樣本溫度下冷凍干燥）。使用鎢鍍膜,。徠卡真空冷凍傳輸至低溫FESEM 5keV,。
會(huì)員登錄
×請(qǐng)輸入賬號(hào)
請(qǐng)輸入密碼
請(qǐng)輸驗(yàn)證碼
收藏該商鋪
X提示
X您的留言已提交成功,！我們將在第一時(shí)間回復(fù)您~
以上信息由企業(yè)自行提供，信息內(nèi)容的真實(shí)性,、準(zhǔn)確性和合法性由相關(guān)企業(yè)負(fù)責(zé),，化工儀器網(wǎng)對(duì)此不承擔(dān)任何保證責(zé)任。
溫馨提示：為規(guī)避購買風(fēng)險(xiǎn),，建議您在購買產(chǎn)品前務(wù)必確認(rèn)供應(yīng)商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量,。