由于自身的不穩(wěn)定性，RNA通常比DNA更難處理,。RNA并不具備DNA穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu),。為了在處理RNA時(shí)保證優(yōu)良品質(zhì)，必須從優(yōu)質(zhì)材料開始,，并在處理前后進(jìn)行特別仔細(xì)的質(zhì)量控制,。所謂的RNA完整性指數(shù)（RIN）是RNA質(zhì)量的指標(biāo)[1]。根據(jù)1到10的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),，RIN值為1表示RNA已wanquan分解,，RIN值為10則表示RNA完好無損。簡言之,，RIN數(shù)值越高,，RNA質(zhì)量越高。只要可能,，應(yīng)始終選用具有高RIN值的材料。

固定并染色樣品制備方法的影響以及后續(xù)紫外激光顯微切片對于小鼠腦組織切片（事后檢查）的影響描述如下,。將冷凍保存且未經(jīng)處理的腦組織切片的RIN值與采用標(biāo)準(zhǔn)方案處理并分離的切片進(jìn)行比較,。圖1顯示了從冷凍切片到RIN分析的樣品制備工作流程。

為了比較未經(jīng)處理的組織樣本與固定和染色的組織樣本，使用3組已知RIN完整指數(shù)（RIN）的冷凍保存小鼠腦組織,。在-80°C冷凍保存后,，將它們轉(zhuǎn)移到冷凍切片刀處，并在-35°C下孵育45分鐘,，然后將組織在-18°C下平衡30分鐘,，接著在-18°C下通過冷凍切片將其切成12µm的切片。小鼠腦組織切片分為兩組,，并按以下方式處理,。一個(gè)是對照組，直接冷凍在-80°C,，另一組則進(jìn)行無RNase的紫外線處理PEN載玻片,。這需要通過在室溫下短暫解凍切片并在冷卻至-20°C的75%乙醇溶液中固定2分鐘來，然后,，立即用幾滴無菌過濾的甲酚紫(CV)染料溶液(含5%甲酚紫的純乙醇溶液)并輕輕來回移動(dòng)孵育45秒,。

在染色過程中,，染料溶液會短暫排除，載玻片浸入一系列濃度遞增（75%,、95%和100%）的乙醇溶液中,，每次4秒鐘，最后固定在100%的乙醇溶液中（試驗(yàn)組）,。完成固定和染色程序之后,，將載玻片在裝有硅凝膠的干燥室中放置45分鐘，然后保存在-80°C的干燥箱中,，等待進(jìn)行激光顯微切片,。

固定和染色之后，相關(guān)組織采用溫和且無污染的紫外激光顯微切片（UV LMD）進(jìn)行分離[2],。這需要使用顯微鏡的10倍物鏡對組織進(jìn)行標(biāo)記并分割成多個(gè)矩形,，然后使用足夠能量的激光束通過“Draw + Cut"（繪圖切割）模式進(jìn)行wanquan消融。切割物收集在0.5ml的無RNase蓋帽中,，以便對RNA內(nèi)容進(jìn)行提純,。這些會保存在–80°C的環(huán)境下，等待進(jìn)行RNA分離,。

兩組樣品,，即保存在在 –80°C下未經(jīng)處理的樣品，以及經(jīng)固定,、染色和激光顯微切片處理的樣品,，接受平行解凍并同時(shí)用相同的試劑處理。按照制造商的說明使用Qiagen的RNase Mini Kit®進(jìn)行提純,。提純的RNA使用30µl的無RNase水洗脫到新的無RNase試管中,。

為了比較天然冷凍組織切片與經(jīng)過CV染色、乙醇固定,、激光顯微切割的組織切片的RNA質(zhì)量,，將來自每個(gè)不同處理樣品的RNA放入同一RNA納米芯片（安捷倫生物分析儀）。RNA納米芯片通過毛細(xì)管凝膠電泳分離RNA樣品,，并根據(jù)樣品在芯片上的移動(dòng)方式對樣品質(zhì)量進(jìn)行分級,。如前所述，RNA質(zhì)量表示為RIN值,，其中10表示wanquan完整的RNA,，1表示wanquan分解的RNA。

此處進(jìn)行的RIN分析（圖2中的樣品測量）表明,，來自直接冷凍的天然組織的RNA樣品的RIN值與根據(jù)UV-LMD標(biāo)準(zhǔn)方案處理的RNA樣品的RIN值沒有太大差異,。

緊接著將分離的RNA樣品分成兩組，每組中有一半的樣品進(jìn)行沉淀。在RNA沉淀后,，根據(jù)參考文件3中提供的說明,，來自天然冷凍組織的已沉淀樣品的RNA的RIN值略低于來自經(jīng)過CV染色、EtOH固定,、UV-LMD處理的樣品的RNA的RIN值[3],。這種差異可能來自沉淀混合物的poly-I，因?yàn)槠渲幸恍┒替淩NA分子在芯片中進(jìn)行RIN測量時(shí)會被提純并與其他RNA一起檢測,，并計(jì)入分解部分,。在qPCR 反應(yīng)中，poly-I沒有產(chǎn)生負(fù)面影響,。因此,，經(jīng)過固定、染色以及紫外激光顯微切片的腦組織切片有沒有進(jìn)行RNA沉淀,，都不會影響其質(zhì)量,。圖2顯示了未經(jīng)處理的天然小鼠腦組織切片和經(jīng)過固定并染色的小鼠腦組織切片在RNA質(zhì)量方面的比較結(jié)果