免疫熒光
IF是一種通過熒光基團標(biāo)記檢測細胞內(nèi)有機分子,，胞內(nèi)定位及其相互作用關(guān)系的成像研究手段。IF制劑可通過多種顯微鏡技術(shù)（如激光共聚焦,、寬場熒光,、全內(nèi)反射成像等）來加以分析，具體取決于應(yīng)用目的或研究人員的關(guān)注重點,。與此同時,，在很多使用至少一套簡易熒光顯微鏡的研究工作組當(dāng)中,，IF早已成為*的一部分。
IF實驗的核心部分是兩種不同組分的組合：

• 首先是特異性抗體，用于形成免疫復(fù)合物來標(biāo)記細胞內(nèi)需要研究的分子,，大多數(shù)情況下為蛋白質(zhì),。

• 其次是熒光色素，與免疫復(fù)合物耦合,，可以利用顯微鏡進行觀察目標(biāo)結(jié)構(gòu)。

圖1：圖中顯示了間接免疫熒光的典型工作流程，上皮細胞粘附在蓋玻片上生長,。培養(yǎng)后細胞被固定,，因此用化學(xué)交聯(lián)劑（如甲醛）將其殺死,。再用清潔劑進行透化處理,，使抗體穿過細胞膜。用正常血清,、奶粉或牛血清白蛋白來進行封閉,，可減少抗體與非靶向結(jié)構(gòu)的非特異性結(jié)合,，從而減少假陽性信號,。接下來與一抗進行孵育,，特異性識別靶向分子上的表位。在第二個培育步驟中，應(yīng)用熒光耦合二抗,，與一抗結(jié)合來實現(xiàn)靶向結(jié)構(gòu)的可視化觀察?？贵w孵育后,，用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料進行細胞核染色,。在顯微鏡載玻片上涂有封固介質(zhì)（例如Mowiol或Prolong Gold）的蓋玻片后，IF即已準(zhǔn)備好進行顯微鏡觀察,。

直接與間接免疫熒光
根據(jù)實驗類型的不同,，有兩種不同的IF變體可以使用：第一種是直接IF或一級IF,，一種具有特異性的一抗，能夠與熒光色素連接用于結(jié)合靶向結(jié)構(gòu)并實現(xiàn)直接可視化觀察,。
第二種變體是指間接或二級IF，這種變體需要采用兩步式培育,。首先，特異性一抗識別靶向結(jié)構(gòu),。然后應(yīng)用與一抗特異結(jié)合的熒光色素耦合二抗,。這種特異性是通過引導(dǎo)二抗抵御產(chǎn)生一抗的物種而獲得的（見‘抗體和熒光色素’章節(jié)）,。比較兩種IF變體可見兩者各有不同的優(yōu)缺點：
通過耦合一抗和熒光色素，耗時的清洗和培育步驟被省略,，所以直接IF比間接IF更快。因此,，直接IF更易于處理，適合于在標(biāo)準(zhǔn)IF實驗中（例如在臨床實踐中）對樣本進行快速分析,。但必須使用一種功能良好且對其抗原高度敏感的一抗,。這同時也是一個缺點,，因為熒光耦合和驗證的一抗成本較為高昂,。此外,，每個靶向結(jié)構(gòu)都需要一個單獨的一抗，與間接IF相比,，抗體與直接IF中的熒光色素的連接限制了設(shè)計實驗的靈活性。
這種靈活性是間接IF的顯著優(yōu)勢之一。通常在IF反應(yīng)過程中,，同一樣本都會有幾個不同的靶結(jié)構(gòu)需要實現(xiàn)可視化觀察，因此必須為每個靶向分子選擇一個離散的熒光色素,。
在間接IF中,，不同的熒光耦合二抗可以與不同的一抗結(jié)合（當(dāng)然還要考慮到物種的反應(yīng)性）,。相較之下,，如果想在直接IF中對靶向結(jié)構(gòu)“玩"顏色組合，則需要為每一種顏色使用單獨的一抗。間接熒光的另一個優(yōu)點是二抗的信號放大,。多個二抗分子可與一個一抗結(jié)合來實現(xiàn)熒光增強,，這意味可減少使用一抗,。
間接IF的工作流程可能需要花費更多時間,，但由于一抗和二抗能夠組合而且整個操作過程的經(jīng)濟性更高，因此間接熒光成為了絕大多數(shù)研究人員的首要選擇方法,。

圖2：有兩種方法通過免疫熒光顯示靶向結(jié)構(gòu)：在兩種變體中，一種特異的一抗用于識別靶分子上的特定表位,。在此圖中,，目標(biāo)分子由幾個相同的蛋白質(zhì)亞單位（=大分子）組成，因此會在每個亞單位上表現(xiàn)出幾個相同類型的表位,。為方便簡化,，此處只描繪了一個表位。

直接IF中,，一抗直接連接到熒光色素,，在顯微鏡下觀察靶向結(jié)構(gòu)。間接IF中,，熒光耦合二抗在第二培育步驟中使用,，從而專門對一抗進行標(biāo)記。因為多個二抗分子可以結(jié)合到一個一抗上,，所以選擇抗體和熒光色素的靈活性更大,，并能夠進一步放大信號。

抗體與熒光色素

高質(zhì)量的IF染色當(dāng)中,，最重要的工具是良好的一抗,。同時，幾乎每種細胞類型中的每種蛋白質(zhì)都有一種或幾種市售抗體,。但此處需要強調(diào)若干重要注意事項,。
要根據(jù)IF染色來做出精確的科學(xué)或臨床聲明，就必須確保一抗對其目標(biāo)抗原的特異性,。在操作中,，研究人員不應(yīng)*依賴商業(yè)供應(yīng)商的說明。應(yīng)根據(jù)之前的使用經(jīng)驗以及文獻中確認有效的一抗來進行抗體選擇,。查看制造商網(wǎng)站上的抗體數(shù)據(jù)表,，查看IF染色的可用圖片并與自身期望相比較，或者與其他已發(fā)布的插圖進行比較,。注意抗體的克隆號,，因為單克隆抗體只與一個表位特異性結(jié)合，而多克隆抗體可識別多個表位,，因此有可能存在非靶向結(jié)構(gòu)的非特異性標(biāo)記,。所以，特異性較高且性能較優(yōu)的單克隆抗體通常更昂貴,，但也能獲得更好的效果,。
如希望開展多色間接IF實驗，則不同的一抗必須衍生自不同的物種,，以便在之后通過熒光耦合二抗來區(qū)分免疫復(fù)合體（見表1）,。比如，您希望使用小鼠衍生的抗體抗蛋白A,、兔衍生的抗體抗蛋白B和大鼠衍生的抗體抗蛋白C來實施IF檢查,。在選擇二抗時必須記住,，每種抗體都只能特定識別一種一抗。此外,，在這三種二抗的例子中,，熒光色素的波長光譜必須不同，以便在顯微鏡分析中辨別熒光信號,。如今,，可以買到與熒光色素相連的二抗，其波長范圍從紫外線到紅外線,，幾乎可以針對任何物種的一抗,。因此，研究人員目前僅受到現(xiàn)有顯微鏡（濾光片組,、激發(fā)激光器）配置的限制,。利用新型的激光器，可以擴展紅外一區(qū)的信號（圖一,、二）,。

表1：此處的多色間接IF示例演示了如何在同一個細胞中同時標(biāo)記三種不同的蛋白質(zhì)。三種蛋白質(zhì)的一抗必須來自不同的物種,，以便用三種不同的熒光色素耦合二抗來進行檢測,。二抗的熒光色素必須在波長光譜上有所區(qū)分才能在顯微鏡下進行不同的分析。

圖一 常見熒光蛋白和熒光素的發(fā)射光譜

圖二 在近紅外一區(qū),，利用新型熒光標(biāo)記可以獲得更多信號,。Cos-7細胞圖像，使用SiR-Actin（657 – 740nm探測范圍）,、AF750-Tom20（760 – 790nm）,、AF790-Tubulin（810 – 850nm）標(biāo)記。樣本由蘇黎世大學(xué)的Jana D?hner和Urs Ziegler提供,。左：使用傳統(tǒng)的GaAsP探測器,。右：使用STELLARIS 8。

了解了借助免疫熒光方法觀察細胞的原理,，接下來獲得目標(biāo)樣本并根據(jù)實驗設(shè)計合理制備用于熒光觀察的樣片,。