制備色譜技術(shù)
閱讀：2871 發(fā)布時間：2007-6-23
制備色譜技術(shù)與操作
1 制備色譜到底是什么,？請介紹一下制備色譜？
有些搞分析色譜的朋友,，對制備色譜這個名詞比較陌生,。其實，在化學(xué)化工醫(yī)藥等廣泛采用的層析法以及薄層色譜就是zui為典型的制備色譜,。下面對制備色譜中的一些常用概念做一下介紹,。
（1）分析色譜的目的，是分析出混合物中一個（或者幾個）純物質(zhì)的含量,。制備色譜的目的,，是從混合物中得到純物質(zhì)。為了加快分離的時間與提高分離的效率，制備色譜的的進樣品量很大,，導(dǎo)致制備色譜柱子的分離負(fù)荷的相應(yīng)加大,，也就必須加大色譜柱填料，增大制備色譜的直徑和長度,，使用的相對多的流動相,。然而，當(dāng)色譜柱上樣品負(fù)載加大的時候,，往往導(dǎo)致柱效急劇下降而得不到純的產(chǎn)品,。制備色譜，要解決容量與柱子效果之間的矛盾,，對重現(xiàn)性也要考慮,。從經(jīng)濟上來說。制備色譜要爭取少用填料,，少用溶劑,，要盡可能多的得到產(chǎn)品。
（2）樣品的前處理： 制備色譜柱子由于處理的樣品多,，比分析柱子更容易受污染,，所以，必要的前處理就顯得非常的必要,。萃取,、過濾、結(jié)晶,、固相萃取等簡單的分離方法,，如果用得上，而且還不是很麻煩,，就要盡可能多的采用以去掉雜質(zhì),。
（3）制備色譜柱的材質(zhì)及其特點
下面介紹一下，制備色譜柱常用的材質(zhì)及其特點,。
各種規(guī)格的玻璃柱子在實驗室里頭很容易得到,，而且價格低廉，但玻璃柱子致命的弱點是它能承受的壓力很小,，且非常容易破碎,。當(dāng)由于壓力太小而導(dǎo)致流動相流速很慢的時候，高位液面或加高壓空氣（或者氮氣）的采用是一個簡單的解決辦法,。在底下加真空,，也能在一定程度上解決這個問題。不銹鋼柱子具有良好的耐腐蝕,、抗壓力性能,，但其價格相對很貴。如果，只有很小的分離任務(wù)且經(jīng)費也允許,，市面上直徑為1cm的小型制備柱就是,。有機玻璃柱子也能抗壓力耐腐蝕,，相對不銹鋼柱子而言,，它是半透明的，可以看到液體的運行狀態(tài),，對有色的物質(zhì)其特點就更為突出,。
（4）固定相的選擇 硅膠、鍵合固定相（如C18）,、離子交換樹脂 ,、聚酰胺、 氧化鋁,、 凝膠等都可以作為色譜柱的填料,。 有不少文獻報道，對填料可以進行一下處理提高了分離效果,，如,，對硅膠進行的硝酸銀（或緩沖液）處理。
（5）裝柱方法的選擇 根據(jù)固定相顆粒度和柱子的尺寸,，采用不同的裝柱方法,，往往裝填越好分離效果越好。裝柱效果跟填料的顆粒度關(guān)系很大,，顆粒度的減少會導(dǎo)致裝柱的難度,。一般來說，顆粒直徑小于20－30um的固定相采用濕法裝填,。所謂“敲擊－裝填”技術(shù)適用于顆粒直徑大于25um的固定相,。濕法的目的是迫使相對稀松的 固定相懸漿以高速裝入色譜柱子，從而減少空隙的形成,。然而,，當(dāng)柱直徑大于20mm，所加壓力為30－40bar時,，高壓懸漿裝填技術(shù)就變得十分復(fù)雜,。為將小顆粒固定相裝入更大得制備型色譜柱，可采用柱長壓縮技術(shù),。這種方法,，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓，利用物理方法將其壓緊,。壓緊的方法有兩種：徑向壓縮和軸向壓縮,。 濕法裝柱需要一定的設(shè)備，在柱子填完后，應(yīng)用有柱效的測量,，對柱效低的柱子應(yīng)該重填,。
（6）流動相的選擇 除了和分析色譜同樣的考慮外，在選用流動相時,，要考慮色譜分離后面加有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等二次分離操作,。一般來說，不宜采用高毒性溶劑,，對多元溶劑要盡可能的少用,。
如果產(chǎn)品中含有大量溶劑，溶劑的純度也要考慮在其中,。
（7）加樣的方法 可以采用以下方法之一進樣,。－用注射器進樣－用旋轉(zhuǎn)閥進樣－通過六通閥進樣－通過主泵進樣－通過輔泵進樣－固體上樣
（8） 泵的選用 生產(chǎn)制備色譜泵的廠商很多。根據(jù)有無脈沖,、能承受的zui大壓力,、控制的精度、售后服務(wù)等來選擇泵,。
（9）檢測器的選用 一般的分析池的zui大允許流速僅為5 mL/min 或者10mL/min,。而專門的制備池的zui大允許流速可為150mL/min。有時,，采用旁路分離管,，將少量流體導(dǎo)入分析池進行檢測，是一個不錯的辦法,，但其濃度的誤差會相對較大,。
（10）組分保留時間的估計 用分析柱子在同等色譜條件下（同樣的固定相和流動相）測定保留時間后，按照單一組分的線流速（不是體積流速）一定,，通過計算可以知道組分的大致保留時間區(qū)域,。
分析譜圖的峰形狀，對確定保留時間也有很大的參考價值,。
（11）產(chǎn)品的收集 手工餾分收集費時費力,，自動餾分收集器有很大的方便。許多實驗室和工廠都采用了餾分收集器,。
（12）超載,、邊緣切割、中心切割,、放大技術(shù)與非線性效用 在制備色譜中,，因為沒有必要達到分析色譜那樣的分離度，可以在一定范圍內(nèi)大大加大進樣的濃度和體積,。在做分離的時候,，也有一些分析色譜的時候,，不能用到的技巧。因為篇幅關(guān)系,，不在這里敘述,。
（13）柱轉(zhuǎn)換技術(shù) 通過接頭或者閥門，實現(xiàn)柱子的簡單延長,，或者比較方便地實現(xiàn)對其中一個（或幾個）組分的精制,。
（14）比較新的制備色譜技術(shù) 模擬移動床可以連續(xù)進樣，并可以利用邊緣切割效用,，而且采用了柱切換技術(shù),，能更好的利用溶劑和填料,，已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn),。其理論和技術(shù)也日益完善。
迎頭色譜,、超臨界流體色譜,、逆流色譜環(huán)形色譜、氣相制備色譜等在科研和工業(yè)生產(chǎn)中也得到了應(yīng)用,。
問: 我想購買waters600用于分析和制備,，對于其配備有什么好的建議。
可以配一個PDA,，另外加一個示差折光410,，另外買幾根制備柱就可以了。
waters600的流速zui大為20mL/min,，一般可以配20mm ID的制備柱,，一次分離10-100mg的樣品，如果樣品量更大,，可以通過配件擴展到45mL/min,，使用30mm ID的制備柱。另外為了保證餾分收集的準(zhǔn)確性,，配上Fraction II 餾分收集器,。
如果樣品數(shù)量很大，可以配2767 sample manager和ZQ MS, 同時做自動進樣并通過MS或U號自動收集餾分,。這樣可以過夜自動運行,。zui大通量每天可以處理100-200個樣品。
2 問： 如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì),？
制備色譜柱為Zorbax SB-C18 9.4＊250mm及gilson餾分收集器,，色譜儀為Agilent 1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì),，初步提純后用高分辨的LC-MS進行定性分析,。如何設(shè)定色譜條件,，如流量，進樣量,，樣品的濃度,，切割點的設(shè)置，是否要濃縮,，要求將95%以上的主峰切除,。（主峰后有二個雜質(zhì)離得很近。）
1 制備用的流動相等級高一點,，否則流動相中的雜質(zhì)會影響LC-MS分析,。
2 使用餾分收集器時，延遲體積一定要計算,，檢測器的響應(yīng)時間設(shè)到zui小,，否則都會影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比,，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min,，9.4mm制備柱用1＊（9.4/4.6）2, 大約為4ml/min。進樣量設(shè)到幾個mg應(yīng)該基本沒有過載,。進樣樣品濃度越高越好,。假如進樣10mg，理論計算0.05%的雜質(zhì)大約只有5ug,，顯然濃度太低,，是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析,。
3 問： 我想用hplc分離一個簡單的多肽,我應(yīng)該選用什么樣的流動相,還有他的梯度,還有選用什么樣的柱子
RP-HPLC,C18柱可以制備很少量的肽,。如果用RP-HPLC，首先應(yīng)該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質(zhì),，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品,，在根據(jù)分析柱子跑出的峰形，逐漸放大純化的方法,。
4 問：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢,？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害，那是不是說它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢,？
（1）TFA起到類似離子對的作用,，一般濃度在0.05-0.1%，過高的濃度,，會使溶液偏酸,，長時間使用可能影響柱子壽命。
（2）同時TFA可以抑制硅膠表面硅醇基,，改善堿性化合物的峰型,。有時0.1%TFA分離不好的話,。可以考慮加大濃度到0.2%,。但要注意用完后及時沖洗色譜柱,。
（3）走梯度時，因為走成基線漂移,，但對制備的影響不大,。
5 問：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？
（1） 了解一下樣品的性質(zhì),根據(jù)其酸堿性,極性等性質(zhì),，通過調(diào)節(jié)溶劑的pH值等, 以達到較好的溶解度,。
（2）樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑（如丙酮等）以助溶,。
（3）不是一定要用流動相來溶解樣品,，對溶解度差的樣品，可以選擇甲醇,，THF或DMSO等溶解樣品,。特別是DMSO，對一般的化合物溶解度都很好,。并且在反相柱上不保留，不會造成干擾,。而且DMSO的洗脫能力很弱,，一般不會影響峰型。
（4） 可以固體上樣,。
6 問：多肽的分離制備, 如何上量,？如何增大分離度?
反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動相,，看保留如何,，若無保留，建議改用其他色譜方法進行分離,。
關(guān)于多肽的分離,，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料,，如孔徑的大小,。我們先在分析柱（4.6MM內(nèi)徑）上做一下實驗,找到zui大的分離度,這一過程的難度是zui大的,要不斷地改變流動相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實驗。
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