當需要以納米級分辨率觀察樣品超微結(jié)構(gòu)時,，科學家通常借助電子顯微鏡（觀察表面結(jié)構(gòu)的掃描電鏡 SEM 和觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)的透射電鏡 TEM）——它們是當前科研界可使用的大顯微成像工具。
電鏡成像要求對樣品進行通常 20-150 nm的超薄切片,，使用超薄切片機切割的切片厚度薄,、表面平整、光滑且無人為干擾因素,，因此可以滿足電鏡成像對制備樣品的嚴苛要求,。如果大量超薄切片具有樣品結(jié)構(gòu)的前后連續(xù)性，SEM 成像采集的圖像就可以進行樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的 3D 重建,，形成可用于分析的完整超微,、精細立體圖像，即連續(xù)斷層成像技術(shù)（Array Tomography, AT）,。
今天,，小編簡要介紹一下 AT 成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：連續(xù)超薄切片樣品制備。
111超薄切片之重要性111
AT 常用于細胞,、蛋白質(zhì)等生物 / 生物大分子結(jié)構(gòu)的納米分辨率,、3D 結(jié)構(gòu)觀察和分析，主要步驟為包埋樣品連續(xù)（超?。┣衅?、TEM / SEM 或光學顯微鏡對其進行成像、對獲得的一系列圖像進行重建分析,。AT 可以獲得的有效信息包括超微結(jié)構(gòu)的定量,、體積分析和細胞 / 蛋白的形態(tài)學數(shù)據(jù)等，相較于共聚焦顯微鏡獲得的圖像,，具有更高的水平和空間分辨率（可達 0.2 nm）,。
超薄切片主要用于 TEM 成像前的樣品制備，以納米分辨率觀察樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息,。無污染且獲取快速的超薄切片的主要優(yōu)勢在于：
整個切片均可用于電鏡成像,，適合大尺寸樣品分析；
單張切片電子透射均一性好,，保證結(jié)果可靠性,；
制備速度快，短時間即可獲得大量切片,；
適用樣品范圍廣,，生物樣本和工業(yè)材料均適用,。
11超薄切片的基本原理11
對于 TEM 或者 3D 結(jié)構(gòu)重建，樣品高質(zhì)量連續(xù)切片是前提,。因此,，一臺如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D（20-50 nm）（見圖 1）一樣穩(wěn)定可靠的超薄切片機是開展實驗的*工具。
▲圖 1. Leica 連續(xù)超薄切片機新品 —— EM ARTOS 3D
樣品被安裝在可上下前后移動的電動機械臂上,，機械臂垂直上下移動,、遇到固定的玻璃刀或鉆石刀時，這條樣品帶被切下（圖 2）,，然后刀臺自動向左移動,，按照設(shè)定的切片厚度完成第二條切割。同理,，隨后刀臺再向左移動,，完成第三條切割（圖 3）。從刀片上直接取下切片是十分困難的,，因為它非常薄且脆弱,，徠卡超薄切片機采用溫和水流托舉的方式使條帶不斷分離，能夠保證條帶質(zhì)量不被破壞同時操作極其簡單（冷凍切片情況可借助顯微操作）,，然后進行上電鏡前的其它必要處理,。
▲ 圖 2. EM ARTOS 3D 超薄切片機樣品切割位置基本結(jié)構(gòu)
▲ 圖 3. EM ARTOS 3D 制備的連續(xù)超薄切片條帶
連續(xù)斷層成像的樣品制備
多數(shù)未處理的生物樣品比較柔軟，AT 成像前的樣品制備主要包括下面幾個步驟：
組織固定
樣品水分抽提和包埋
連續(xù)切片和切片條帶收集
切片染色以用于成像（如果需要）
后使用 SEM 或光學顯微鏡（通常熒光成像情況）對結(jié)構(gòu)上具有連續(xù)性的切片進行成像,，合成圖像以進行 3D 重建和分析,。
對于市面上多數(shù)超薄切片機，使用者在 AT 成像的樣品制備時,，通常會發(fā)現(xiàn)這是一項耗時耗力,、中間一些操作必須手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的 3D 連續(xù)超薄切片機,，能夠自動化連續(xù)切片,、顯著縮短樣品制備時間、減少人工操作,、切片無褶皺,、厚度均一、溫和水流取條帶,、提高樣品制備成功率等眾多優(yōu)點,，在向下兼容普通超薄切片需要的同時，特別合適高通量切片和 AT 等前沿研究對樣品制備的嚴苛要求
1111111數(shù)據(jù)展示1111111
▲ 圖 4. AT 技術(shù)獲得的鼠淋巴結(jié) 3D 結(jié)構(gòu)重建
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