熒光是George Gabriel Stokes于1852年shouci報(bào)道的一種現(xiàn)象,。他觀察到螢石在紫外線照射后開始發(fā)光。熒光是光致發(fā)光的一種形式,,是指一種材料被光照射后會(huì)發(fā)射出光子,。發(fā)射光的波長比激發(fā)光更長。這種效應(yīng)又稱為斯托克斯位移,。
熒光在顯微鏡中有著廣泛的應(yīng)用,,是觀察特定分子分布的重要工具。細(xì)胞中的絕大多數(shù)分子并不會(huì)發(fā)出熒光,,因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進(jìn)行標(biāo)記,。對(duì)于感興趣的分子可以直接標(biāo)記(例如,用DAPI標(biāo)記DNA),,或者使用可與特異性抗體偶聯(lián)的熒光素進(jìn)行免疫染色,。免疫染色時(shí)通常必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。
熒光顯微鏡還可對(duì)活細(xì)胞或組織進(jìn)行延時(shí)成像,。為此,,對(duì)于感興趣的蛋白質(zhì)可以使用基因編碼的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記,如GFP(綠色熒光蛋白),。對(duì)于感興趣的分子(如Ca2+)還可以使用可逆結(jié)合的合成染料(如fura-2)或轉(zhuǎn)基因天然蛋白質(zhì)(如GFP衍生物)進(jìn)行標(biāo)記,。
圖1:當(dāng)特定波長(激發(fā)波長)的光照射到分子上(例如照射到熒光團(tuán)中)時(shí),光子會(huì)被分子的電子吸收,。然后,,電子從它們的基態(tài)(S0)提升到更高的能級(jí),即激發(fā)態(tài)(S1’),。這個(gè)過程被稱為激發(fā)(1),。激發(fā)態(tài)壽命很短(通常為10-9/-10-8秒),在此期間電子的一些能量會(huì)丟失(2),。當(dāng)電子離開激發(fā)態(tài)(S1)返回基態(tài)(3)時(shí),,它們會(huì)失去在激發(fā)過程中獲得的剩余能量,。熒光團(tuán)的獲得的能量會(huì)以光子形式釋放,釋放的光子波長以比激發(fā)光波長更長,,從而能量更少,。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯位移。
圖2:COS 7細(xì)胞,,綠色:無特征蛋白質(zhì),,GFP,紅色:α-微管蛋白,,Cy3,,藍(lán)色:細(xì)胞核,DAPI,。感謝中國上海SIBS、CAS,、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所邊瑋提供的圖片,。
圖3:小鼠成纖維細(xì)胞,綠色:F-肌動(dòng)蛋白,,F(xiàn)ITC,,紅色:微管蛋白,Cy5,,藍(lán)色:細(xì)胞核,,DAPI。感謝德國海德堡Max Planck醫(yī)學(xué)研究所Günter Giese博士提供的圖片,。
圖4:小鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞,,藍(lán)色:轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記;綠色:肌動(dòng)蛋白,,TRITC,;紅色:GluA Ampa受體單位,Texas Red,;灰色:突觸小泡蛋白,,Cy 5
圖5:果蠅幼蟲,綠色:RNA結(jié)合蛋白,,Alexa 488
由于磷光分子發(fā)光的時(shí)間比熒光素長得多,,因此它們儲(chǔ)存激發(fā)能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎(chǔ)在于兩種形式的激發(fā)能級(jí),,即單重激發(fā)態(tài)和三重激發(fā)態(tài)都基于不同的自旋排列,。
自旋是電子的一種屬性。簡單來說,,自旋描述了由電子旋轉(zhuǎn)引起的角動(dòng)量,。電子的自旋方向可以是正方向(+1/2),,也可以是負(fù)方向(?1/2)。更高能級(jí)的自旋配對(duì)可以在相互方向上平行或反平行,。在反平行自旋配對(duì)中,,單個(gè)角動(dòng)量相互補(bǔ)償,同時(shí)自旋總值為零,。這種自旋排列就稱為單重態(tài),。兩種平行自旋互不補(bǔ)償且所得數(shù)值不同于零值,在這種情況下,,自旋被稱為三重態(tài),。
當(dāng)電子從單重態(tài)激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí),就會(huì)產(chǎn)生熒光,。但在某些分子中,,被激發(fā)電子的自旋可以在一種稱為系統(tǒng)間交叉的過程中轉(zhuǎn)換為三重態(tài)。這些電子失去能量,,直到它們處于三重基態(tài),。這種態(tài)比基態(tài)具有更高的能量,但也比單重態(tài)激發(fā)態(tài)具有更低的能量,。因此,,電子無法切換回單重態(tài),也不能輕易地返回基態(tài),,因?yàn)榱孔恿W(xué)只允許自旋總值為零,。因此分子被困在其能量狀態(tài)當(dāng)中。
但從三重基態(tài)到基態(tài)的一些變化有時(shí)還是有可能的,。這些變化會(huì)發(fā)射出光子和磷光,。由于一次只有少數(shù)事件可能發(fā)生,三重基態(tài)呈現(xiàn)為能量儲(chǔ)庫的形式,,因此能夠在更長的一段時(shí)間內(nèi)發(fā)出磷光,。
對(duì)于顯微鏡,熒光是最為實(shí)用的一種冷發(fā)光,。熒光素可以很容易地通過特定的光源(如燈和濾光系統(tǒng)或激光器)在特定波長下激發(fā),,發(fā)射光和激發(fā)光可以通過波長來加以區(qū)分(斯托克斯位移)。
利用熒光成像,,實(shí)驗(yàn)室人員可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子數(shù)量和位置進(jìn)行特征描述。熒光顯微鏡的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使用幾種熒光素,。熒光素只需其激發(fā)和發(fā)射波長不同即可,。因此,不同目標(biāo)分子均可同時(shí)觀察并開展大量的實(shí)驗(yàn),,例如開展共定位的研究等,。
圖6:果蠅,幼蟲齡期,,綠色:Feb211陽性神經(jīng)元及其軸突,,Alexa 488,;紅色:CNS纖維部分(即所有軸突),,Cy3,;藍(lán)色:細(xì)胞核,DAPI,。感謝德國Eggenstein-Leopoldshafen毒理學(xué)與遺傳基因研究所,Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的圖片,。
圖7:小鼠腎臟切片,,綠色:腎小球和腎曲小管,,Alexa 488 WGA;紅色:F-肌動(dòng)蛋白(普遍存在于腎小球和刷狀緣),;藍(lán)色:細(xì)胞核,,DAPI
圖8:新生心肌細(xì)胞,黃色:DNA,,DAPI,;綠色:肌間蛋白,Cy3,;紅色:鈣粘蛋白,,Texas Red,;藍(lán)色:肌動(dòng)蛋白,Alexa 633
圖9:熒光顯微鏡下獲得的分裂中期FISH染色染色體,。感謝東京大學(xué)前沿科學(xué)研究生院人類進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室Yumiko Suto博士提供的圖片,。
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