本文展示了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）實現(xiàn)尤文（尤因）肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié)觀察,，從而協(xié)助本研究的進行,。活細胞成像等技術(shù)在了解腫瘤進展和轉(zhuǎn)移研究中至關(guān)重要,。真核細胞中的有絲分裂紡錘體由中空的微管組成,。它在有絲分裂期間的細胞內(nèi)重復染色體分離和分裂細胞細胞骨架結(jié)構(gòu)的構(gòu)建過程中發(fā)揮著重要的作用。在尤文肉瘤這一類的腫瘤細胞中,，有絲分裂障礙的觸發(fā)因子可通過檢查有絲分裂紡錘體的機能障礙來得以確認。
簡介
使用熒光顯微鏡可以研究腫瘤形成和進展過程中組織及細胞內(nèi)部發(fā)生的變化,。像活細胞成像這樣的技術(shù)對更加深入地了解腫瘤進展和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的,。
在真核細胞中，由中空微管組成的有絲分裂紡錘體,，有助于構(gòu)建復制細胞的細胞骨架結(jié)構(gòu),，并在有絲分裂過程中將復制的染色體從原始細胞中分離出來。在尤文肉瘤這一類的腫瘤細胞中,，有絲分裂障礙的觸發(fā)因子可通過檢查有絲分裂紡錘體的機能障礙來得以確認[1],。
肉瘤是肌肉或骨骼等結(jié)締組織中形成的一類腫瘤。尤文肉瘤和橫紋肌肉瘤,，分別生長于骨骼和肌肉中,，是一種傾向于發(fā)生在骨骼生長活躍區(qū)域附近的兒科腫瘤。除了手術(shù)和化療之外,，電離輻射也被用于治療這類腫瘤,，但這可能會導致生長中的骨骼受到y(tǒng)ong久性損傷，包括不對稱生長停滯,、脛骨畸形及骨折概率增加等,。骨骼損傷的嚴重度在很大程度上與骨骼接受的輻射劑量成正比。因此，我們有理由認為,，選擇性放射致敏腫瘤組織的策略可降低實現(xiàn)局部控制所需的輻射劑量,，并能最大限度降低對鄰近健康組織造成的間接損傷。
運用體外研究和小鼠異種移植模型系統(tǒng),，對使用mRNA合成抑制劑光神霉素A預處理,，可以通過改變輻射損傷的轉(zhuǎn)錄反應實現(xiàn)選擇性放射致敏EWS：Fli1+腫瘤細胞的假設進行了驗證[2]。結(jié)果表明,，光神霉素A可以通過抑制參與DNA損傷修復相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,，使EWS：Fli1+細胞在體內(nèi)外顯著放射增敏，導致腫瘤細胞程序性死亡[2],。
使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié),，協(xié)助癌癥研究人員獲得更有用的見解。
挑戰(zhàn)
在有絲分裂紡錘體成像中,，可對其實現(xiàn)快速成像,，并獲得清晰的高對比度3D成像，以清晰展示重要細節(jié)的解決方案最為實用,。傳統(tǒng)的寬場顯微成像速度快,，檢測靈敏度高，但不幸的是對于厚樣本的成像通常會出現(xiàn)失焦不清晰或模糊的情況,，這會降低對比度[3],。要闡明有絲分裂的不穩(wěn)定性在癌癥等復雜疾病中的作用，這需要在同一樣本中進行多個關(guān)聯(lián)生物學標記,。
方法
該研究中使用了尤文肉瘤細胞（SK-ES-1）,。對這些細胞進行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀釋/ Dylight 488偶聯(lián)驢抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）,、γ-微管蛋白（Clone TU-30,，AbCam # ab27074，按1:200比例稀釋/Dylight 550偶聯(lián)驢抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342藍）進行染色,。染色后,，使用介質(zhì)ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）進行蓋玻片封片，并通過使用63×/1.4 NA（數(shù)值孔徑）的油鏡進行THUNDER Imager Tissue成像,。圖像采集使用大體積成像解析（LVCC）[3]模式,，并生成zui大化投影圖像數(shù)據(jù)。
結(jié)果
在有絲分裂過程中,，α-微管蛋白（綠色）形成有絲分裂紡錘體,，染色單體（藍色）會附著在有絲分裂紡錘體上，而γ-微管蛋白（紅色）集中定位在分裂細胞中的紡錘極上,。通過THUNDER技術(shù)可觀察到肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié),。清晰的圖像可以展示清晰的結(jié)構(gòu)，以便進行分割和進一步的分析。
圖1：尤文肉瘤細胞SK-ES-1 α-微管蛋白（綠色）,、γ-微管蛋白（紅色）和DNA（藍色）染色后的最da化投影：原始圖像數(shù)據(jù)（左）和THUNDER LVCC模式成像數(shù)據(jù)（右）,。
結(jié) 論
THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]進行尤文肉瘤細胞中的有絲分裂紡錘體成像時可顯著增強對比度。與傳統(tǒng)的寬場成像相比,，其可展示細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節(jié),。
References：
1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Mu?oz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.
2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
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