從成像到分析
Caspases與細胞凋亡過程相關(guān),，因此可以利用caspase檢測來確定細胞是否正在經(jīng)歷這種程序化的細胞死亡,。這些檢測可以通過例如流式細胞儀、平板讀數(shù)儀實現(xiàn),，也可以在顯微鏡上完成，顯微鏡可為量化數(shù)據(jù)補充可見的結(jié)構(gòu)信息,。在這篇文章中，我們描述了MICA是如何用于caspase 3/7測定,。借助Navigator或像素分類器等工具，MICA讓設(shè)置,、執(zhí)行和分析caspase 3/7檢測變得更加容易，即使沒有經(jīng)驗的用戶也可輕松操作,。
圖像：雙色caspase檢測并進行拼接掃描,。U2OS細胞用核標記物DRAQ5（品紅）和CellEvent™（黃色）標記。加入4mM星形孢菌素以誘導細胞凋亡,。20倍物鏡下使用雙通道熒光，持續(xù)16小時每30分鐘獲取一次2x2 FOV（視野范圍）的掃描拼接圖像,。
凋亡細胞檢測或者活細胞/死細胞檢測一般通過將某種物質(zhì)應(yīng)用于活細胞并觀察細胞反應(yīng),，以此檢測其毒性或有效性。死亡率隨時間推移而上升或者劑量依賴性上升均證明物質(zhì)有效,。判斷潛在藥物的抗癌效果便是一個典型示例。
商用染料試劑盒可檢測處于凋亡狀態(tài)的細胞,。這些試劑盒內(nèi)染料為熒光染料，能夠分別標記活細胞和死亡細胞,。
Caspase活性檢測法是細胞凋亡檢測法的一種,。Caspase（半胱天冬酶）是參與細胞凋亡過程的一類半胱氨酸蛋白水解酶,。它們還用于區(qū)分caspase介導的細胞凋亡或細胞壞死。
這里的染料試劑盒使用的是DNA結(jié)合試劑,，該試劑的熒光能夠被四氨基酸肽(DEVD)阻斷,。一旦caspase-3和caspase-7（caspase-3/7）被激活，即當細胞處于凋亡狀態(tài)時,，caspase-3和caspase-7便會切割DEVD肽,，然后DNA結(jié)合試劑便會開始呈現(xiàn)熒光（見視頻1）,。
由于添加劑濃度不同,、孵育時間不同、染色類型或者細胞系不同等參數(shù)的不同,，實驗通常在多孔板上進行,。這種方法有兩個優(yōu)點，一是能夠在一個反應(yīng)容器中設(shè)置多個不同的試驗條件,，二是只需要極少量的試劑和極低數(shù)量的細胞,。
但是,，在實施過程中，用戶仍然可能會被不同孔和不同實驗的數(shù)量混淆,。
設(shè)置多孔板實驗時,，MICA自帶的Navigator工具能夠幫助預(yù)覽,。包括可以在虛擬畫板上計劃并設(shè)置每一孔的掃描拼接實驗或者延時實驗（見圖1）,。
追蹤細胞活動需要使單一熒光通道的時空相關(guān)性成像,。傳統(tǒng)的寬場顯微鏡一般一次記錄一個通道，因此每一個細胞結(jié)構(gòu)只能按順序,、一個接一個地記錄下來,。這意味著兩個不同的結(jié)構(gòu)記錄于兩個不同的時間點。這對于極速發(fā)生的細胞事件來說可能會產(chǎn)生影響,，特別是在共定位研究中,。
同時成像通過在同一時間記錄全部熒光的方法規(guī)避了這一缺點,。對于caspase活性檢測法而言,，這意味著用戶能夠觀察到，例如在caspase-3/7被激活的瞬間線粒體的反應(yīng),。
MICA甚至能夠同時檢測四種熒光,，使用戶可以同時觀察到除細胞核、caspase-3/7活性,、線粒體等之外的另一個細胞結(jié)構(gòu)（見圖5）。
最后,，如果想要確定某一特定試劑在誘導caspase介導細胞凋亡時的效果,，則需要對caspase檢測進行量化,。這種量化需要通過專門的外部軟件來實現(xiàn),。
MICA自帶分析解決方案,，不需要另外的軟件。通過MICA自帶的像素分類器,，用戶能夠標記一些感興趣區(qū)域（ROI），人工智能算法通過這些標記區(qū)域能夠檢測所有其他的感興趣區(qū)域（見圖2）,。對于caspase活性檢測法而言,，細胞核信號可用于確定細胞總數(shù)。CellEvent™信號可用于識別caspase介導的凋亡細胞
在這一案例研究中使用的檢測法中,， U2OS細胞或者COS7細胞被鋪在96孔板,，然后培養(yǎng)一整晚的時間,。在實驗過程中，活細胞分別用DRAQ5,、SPY-650-DNA以及TMRE孵育15分鐘。之后,，更換培養(yǎng)基，在實驗結(jié)束前使用CellEvent™孵育細胞,。每孔內(nèi)加入凋亡誘導劑星形孢菌素（3 µM–7 µM）,。
在四色caspase活性檢測法中,，U2OS細胞被接種在96孔板上并在夜間生長,，然后培養(yǎng)一整晚的時間,。在實驗過程中，活細胞與DAPI和TMRE孵育45分鐘,。之后,，更換培養(yǎng)基，在實驗結(jié)束前使用CellEvent™和SiR-Tubulin孵育細胞,。每孔內(nèi)加入凋亡誘導劑—星形孢菌素（3 µM–7 µM）,。
在37℃,、5% CO2和~65%濕度的環(huán)境中，按照指示的時間間隔和持續(xù)時間用MICA進行活細胞成像,。使用Navigator工具設(shè)定并執(zhí)行檢測,。一些實驗中會運行掃描拼接（參見視頻2）。進行掃描拼接時,，研究人員使用的主要策略是“focus Map”,；此外,，延時實驗通過“Keep focus”來保持細胞的聚焦。
視頻 2：三色caspase活性檢測的掃描拼接片,。U2OS細胞分別用核標記SPY-650-DNA（藍色）,、線粒體膜電位標記TMRE（品紅）和CellEvent™（黃色）處理,。加入5mM星形孢菌素以誘導細胞凋亡,。使用20x物鏡,，在明亮視野和兩種熒光通道下，12小時內(nèi)每15分鐘獲取一次2x2 FOVs（視野范圍）的掃描拼接圖像,。隨著時間增加,，Caspase活性增強,，線粒體活性減弱,。
使用MICA自帶的分析功能進行本次實驗中的數(shù)據(jù)分析,。其中核心組件之一便是人工智能驅(qū)動的像素分類器，該功能位于“學習”選項,。
通過像素分類器,，用戶能夠標記其感興趣區(qū)域（ROI），該區(qū)域?qū)⒆鳛樗幸獧z測的其他區(qū)域的示例,。如圖5所示，細胞核被像素分類器標記并檢測,。像素分類器同樣能夠標記并檢測線粒體活性標識TMRE和caspase呈陽性的細胞,。之后會在整個延時攝影過程中分析這批圖像。
經(jīng)過計算之后,，MICA會將計算結(jié)果以散點圖,、共定位圖、直方圖,、餅狀圖,、框圖或者時間序列圖的形式展示在“結(jié)果”選項中。
SPY-650-DNA（標記細胞核）和CellEvent™（標記caspase 3/7活性）兩種細胞染料的量化研究揭示了在活細胞實驗中發(fā)生caspase介導的凋亡的細胞,。細胞核的數(shù)量（此處選擇“范圍”參數(shù)做類比）說明了每張圖像中細胞的數(shù)量（同選“范圍”）,，可與處于凋亡過程中細胞的數(shù)量（同選“范圍”）相對應(yīng),。另一個標記,，即TMRE成像過程,，揭示了線粒體活性。
量化數(shù)據(jù)(如長度,、寬度,、面積)顯示在采集圖像下方的表格中，這些數(shù)據(jù)可被導出為Excel表格,。獲取的圖像可以在延時成像的每一個時間點上查看，并可以與識別的ROI重疊,。
三色caspase 3/7活性檢測圖（圖4）顯示,，細胞核信號在開始的時候增強，之后逐漸減弱,。信號增強是因為核染色劑必須與DNA結(jié)合,，這一結(jié)合過程需要一定的時間,。另一方面,，SPY-650-DNA信號減弱是因為細胞核解體，解體現(xiàn)象見相關(guān)圖像,。
其他信號要么隨時間增加而增強（CellEvent™）,，要么隨時間增加而減弱（TMRE）： caspase介導的凋亡細胞數(shù)量增加的同時激活狀態(tài)的線粒體數(shù)量減少。
用戶可以通過MICA一次性對四種熒光成像,。在caspase 3/7活性檢測法中,，這有助于調(diào)查凋亡過程中額外的細胞成分的命運—實現(xiàn)*時空相關(guān)性。圖5中展示的案例顯示,，除了細胞核（DAPI）,、激活狀態(tài)的線粒體（TMRE）以及caspase陽性細胞（CellEvent™）以外，也對肌動蛋白細胞骨架（SiR-Actin）進行了染色,。
高倍率下（63x）,，用戶能夠看到，caspase被激活之后,，肌動蛋白細胞骨架坍塌,。與此同時細胞核以及線粒體停止工作。因為所有通道都是在一次拍攝中獲得的,，各細胞活動成像之間存在精確聯(lián)系,。
Caspase活性檢測法為研究抗癌藥物提供了新的見解,。為了實現(xiàn)這一目標，研究人員必須在保證高時空精準度的情況下將活細胞從凋亡細胞中區(qū)分出來,。
對于統(tǒng)計上可靠的結(jié)果,，增加量很有必要,。這就是為什么這類實驗必須在孔板上進行,，也必須進行量化研究。
MICA滿足以上全部要求,。在FluoSync的幫助下,，Mica可同時保證多達4種不同的熒光染料可以同時成像，不論是在單一培養(yǎng)皿上,，還是在96孔板上,。MICA完整的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠培育活細胞數(shù)日，同時其自帶的基于人工智能的分析功能也有助于用戶獲得可靠的數(shù)據(jù),。
8
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)