為了拆分多色成像的發(fā)射光譜,，首先由分束器或色散元件將不同顏色的光引入到不同的方向[1],，帶通濾片則能夠最大限度地減少串色,，并抑制所有殘留的激發(fā)光，最終到達(dá)傳感器,。在過去,，常使用的濾片是普通的玻璃帶通濾片。如今,，一項(xiàng)革命性的設(shè)計(jì)誕生了,，那就是在多波段組件（探測器）中使用光度計(jì)滑塊。該設(shè)計(jì)可以極為有效地探測發(fā)射光,，同時(shí)提供*可調(diào)諧性,，與此同時(shí)帶來的好處是使光譜掃描成為了可能。使用白激光作為光源時(shí),，可調(diào)諧光譜檢測器是與可調(diào)諧光源光譜自由度匹配的設(shè)備,。其他的光譜檢測設(shè)備使用一系列檢測元件，其波段是固定的,，但它們不可調(diào)諧,，靈敏度較低。
玻濾光片
在以前,，熒光顯微鏡總是使用玻璃濾光片作為屏障濾光片,。極早期的熒光顯微鏡是透射系統(tǒng)，即它們在透射光下進(jìn)行操作,。后來該技術(shù)*被反射光束路徑（落射光）取代,，入射光系統(tǒng)可以更好的進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射分離。由于熒光強(qiáng)度僅為照明的約10-4到10-10倍[2],，所以這是一個(gè)至關(guān)重要的要求,。屏障濾光片必須完成兩個(gè)任務(wù)：首先，盡量阻擋雜散光（由于樣品或光學(xué)組件中的反射,，殘留激發(fā)光到達(dá)探測光路）,。其次，如果樣品含有多種熒光物質(zhì)（減少串色）,，屏障濾光片可以進(jìn)一步縮小收集的光譜帶寬以增強(qiáng)通道信號的特異性,。
玻璃濾光片可能由有色玻璃材料制成，有多種不同顏色,。然而,，有色玻璃的性能取決于其使用的化合物，除了混合各種化學(xué)品來接近所需的透射性質(zhì)外,，沒有其他方法來設(shè)計(jì)光譜特性,。在設(shè)計(jì)上更靈活的濾光片基于多層涂層（沉積在透明玻璃上）。這種涂層或多或少為設(shè)計(jì)可見光譜內(nèi)的任何帶通提供了選擇,?？梢杂酶鼜?fù)雜的涂層作為多通濾片,，具有三個(gè)或四個(gè)透射波段，中間有反射部分,，允許多重激發(fā)和檢測,。
盡管多層涂層技術(shù)非常先進(jìn)，但此類設(shè)備的局限性在于其不可調(diào)性,。為了用于多種染料之間的組合,，系統(tǒng)必須配備一組此類濾光片，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,，這些濾片必須通過手動(dòng)或電動(dòng)操作插入光路,。這使得基于濾片的系統(tǒng)的靈活性變差，實(shí)驗(yàn)效率低下,。
圖1：基于有色玻璃或干涉涂層的經(jīng)典帶通濾片,。要更改探測光譜區(qū)間，必須更換濾片,。這需要許多濾光片和電動(dòng)交換裝置(©–.),。
多波段分光光度計(jì)：探測器
還有一種*不同的方法可以從整個(gè)光譜中選擇所需波段,，即使用與光譜重疊的機(jī)械設(shè)備,。如果一束光穿過色散元件（棱鏡或光柵），色散后的光會(huì)根據(jù)其能量在空間上擴(kuò)散,，光子的能量與顏色相對應(yīng),。舉一個(gè)簡單的例子，將色散后的光投影到白色表面上,，即可觀察到生成的光譜,。長期以來，人們用相紙來記錄和定量,。而現(xiàn)在,，人們用數(shù)碼相機(jī)芯片來查看和分析光譜分光鏡）。
除此以外,，也可以通過在白色表面的位置插入機(jī)械狹縫,，并測量透射能量來從整個(gè)光譜中選擇一個(gè)窄帶。狹縫的位置可以在光譜上移動(dòng),，然后測量能量分布作為位置的函（光譜儀）,。
不同顏色的發(fā)射光對應(yīng)的能量也不同。為了檢測樣本發(fā)射光的全部能量,，需要打開狹縫并將其居中,，檢測窗口就會(huì)覆蓋發(fā)射光譜，并屏蔽光譜的其他部分,。這種器件是一種帶通濾波器,，它的優(yōu)點(diǎn)是中心頻率和帶寬都可調(diào)諧——它包括任何（單）帶通濾波器的可能,。此類器件與適當(dāng)?shù)膫鞲衅鳎ɑ颍┙Y(jié)合使用，就成為了共聚焦顯微鏡通用,、靈敏的檢測器,。
如前所述，頻帶光譜儀只能用于單通道實(shí)驗(yàn),。然而,，生物醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)代熒光實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)檢測多個(gè)通道。通過串聯(lián)機(jī)械狹縫裝置可以巧妙地解決這個(gè)問題[3],。在這種多波段探測系統(tǒng)（后稱為“探測器"）中,，機(jī)械狹縫元件類似于高反射鏡。第一個(gè)通道所需的波段通過狹縫后,，光譜的其余部分被引導(dǎo)到后續(xù)的探測器（幾乎無損失）,，到達(dá)這些探測器之前再次被反射鏡滑塊進(jìn)行選擇。理論上,，可以無限串聯(lián)這種波段探測器,。由于現(xiàn)實(shí)原因，目前的設(shè)備最多備5個(gè)傳感器,。
該設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是效率高（狹縫透過率100%,，反射鏡反射率99%），所有波段的獨(dú)立自由光譜都可以進(jìn)行調(diào)諧,。當(dāng)用白激光（可調(diào)諧光源）進(jìn)行照明時(shí),，探測器是一個(gè)能合理地整合激發(fā)的高度靈活的裝置。此外,，每個(gè)通道都配有專用的傳感器,，可以進(jìn)行獨(dú)立的電子放大和基線設(shè)置。
圖2：探測器采用玻璃棱鏡,，具有高透射率和分光性能,。通過可移動(dòng)的反射鏡滑塊將光譜分成多個(gè)波段。這使得光譜可以分成任何可能的子光譜集,，然后被檢測器通道測,。。
其他方法
繼檢測器后,，其他的一些設(shè)計(jì)相繼問世,，旨在配合多波段方法的優(yōu)勢。其中之一陣列檢測器,，通常是多陽極光電倍增管,，將光譜投射到其上[4,5]。雖然這些設(shè)備可以更簡單地放大檢測信號,，但它們有明顯的缺點(diǎn)：由于必須對不同部分進(jìn)行機(jī)械分離,，使用多陽極陣列會(huì)使得收集的光子減少,。它們受到光電串?dāng)_的影響，無法單獨(dú)調(diào)整放大功率,。這些波段本質(zhì)上是固定的,，即不可調(diào)諧，因此無法適用于當(dāng)今使用的熒光染料的各種發(fā)射特性——未來發(fā)射特性會(huì)越來越復(fù)雜,。這些設(shè)備不輸出分配給單個(gè)發(fā)射種類的信號,，而只是輸出光譜的固定部分。因此,，它們必須要通過分解算法對記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理,，以獲得有意義的通道數(shù)據(jù)。（使用探測器,，將信號分配給不同發(fā)射種類,，此時(shí)分離可以清除殘留重疊。）
陣列探測器還強(qiáng)制要求發(fā)射光具備線性色散,。因此無法在配備了陣列探測器的系統(tǒng)中使用棱鏡,，所以只能使用光柵，但其性能具有重大缺陷,。第一,，光柵輸出不均一，衍射的最大值位于閃耀波長處,。因此,，在較長和較短波長下收集的數(shù)據(jù)低于真實(shí)值,。第二,，光柵對偏振的依賴性很強(qiáng)，對非偏振光（這是生物熒光發(fā)射的典型情況）的衍射效率會(huì)降低到50-70%左右（針對表現(xiàn)好的顏色）,。因此需要使用其他光學(xué)元件彌補(bǔ)該缺陷[6],。光柵的第三個(gè)問題是：輸入能量不僅在單一光譜中釋放，而且還釋放進(jìn)入了0階和更高階的散射光中去,。這降低了所有光柵的整體衍射效率,。同樣也引入了其他更多的光學(xué)設(shè)備來解決這個(gè)問題[7]。
這些設(shè)備都是基于記錄光譜的理念而設(shè)計(jì)的,。然而,，除非在非常罕見的情況下，熒光成像不需要記錄光譜,。熒光成像需要重新計(jì)算低效獲得的光譜以提供有意義的染料信息,。探測器不會(huì)受到高階損耗的影響，也不會(huì)受到偏振相關(guān)的影響,。它提供*可調(diào)的檢測帶,，并具有單獨(dú)的放大功能,。它可以進(jìn)行線性分解處理，這是一個(gè)額外的優(yōu)勢—意味著同時(shí)也可以在高分辨率下記錄光譜[8],。因此將可調(diào)白激光與可調(diào)檢測設(shè)備進(jìn)行組合是非合理的,。
圖3：單點(diǎn)探測器（探測器）可以調(diào)整樣品中各種染料發(fā)射的動(dòng)態(tài)差異。與多陽極陣列探測器相反,，兩個(gè)探測窗口都是可調(diào)的,，并且可以單獨(dú)調(diào)整動(dòng)態(tài)范圍。
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