可視化生命分子動力學
理解復(fù)雜和/或快速的細胞動力學是探索生物過程的重要一步。因此,，當今的生命科學研究越來越關(guān)注實時動態(tài)過程,，如細胞遷移，細胞,、器官或整個動物的形態(tài)變化以及活體標本的實時生理（例如細胞內(nèi)離子組分的變化）事件,。解決這些挑戰(zhàn)性需求的一種方式是采用被統(tǒng)稱為活細胞成像的光學方法?；罴毎上窨裳芯炕罴毎膭討B(tài)過程,，而非提供細胞當前狀態(tài)的“快照"——它把快照變成了電影?；罴毎上窨商峁﹩蝹€細胞,、細胞網(wǎng)絡(luò)（原位）甚至整個生物體（體內(nèi)）中動態(tài)事件的空間和時間信息。這些特點讓活細胞成像成為解決細胞生物學,、癌癥研究,、發(fā)育生物學和神經(jīng)科學問題的必要技術(shù)。
近年來,，電子學,、光學和分子生物學都取得了重大進步，科學家們可以很容易地進行活細胞成像,。
用于活細胞成像的方法
顯微技術(shù)在活細胞成像方面的應(yīng)用也非常廣泛,。通常，使用復(fù)合顯微鏡和對比方法（例如相差和微分干涉相差（DIC））隨著時間觀察細胞的生長,，細胞聚集或細胞運動,。此外，通常使用立體顯微鏡或宏觀鏡進行較大樣本（例如斑馬魚胚胎發(fā)育）的延時成像,。在過去數(shù)十年中,，先進熒光技術(shù)變得越來越重要。隨著共聚焦顯微鏡應(yīng)用的迅速增加,，生物研究的視角已由平面轉(zhuǎn)向三維,。以下是一些常用技術(shù)的簡要概述,。
離子成像——觀察離子濃度的變化
一種常用的方法是使用熒光染料或特別設(shè)計的蛋白質(zhì)來改變其在鈣結(jié)合時的發(fā)射行為的離子成像（鈣、氯,、鎂）,。這使得研究人員可以觀察到細胞離子濃度的動態(tài)變化。由于細胞胞質(zhì)溶膠中的離子組成決定了細胞的很多重要功能,，如神經(jīng)元的興奮性,、基因轉(zhuǎn)錄和細胞運動（僅舉幾例），細胞內(nèi)離子在空間和時間上的調(diào)節(jié)是生物學研究的主要興趣,。此外,，使用特殊的熒光染料可以對細胞內(nèi)的pH值或電壓進行成像。一種用來對離子水平,、pH值或電壓變化進行成像的特殊技術(shù)是比率成像法,。這些方法能夠精確確定細胞內(nèi)鈣濃度等信息，而非像非比率方法那樣監(jiān)測相對變化,。
FRET – 量化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
要檢測動態(tài)蛋白質(zhì)相互作用,，可以在活細胞實驗中對FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）和BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）事件進行成像。FRET是量化分子動力學的有利工具,，如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,、蛋白質(zhì)-DNA相互作用和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化等。FRET成像通常使用GFP（綠色熒光蛋白）的衍生物,，尤其是CFP和YFP（分別為青色和黃色熒光蛋白）,，它們各自使用分子生物學方法連接到感興趣的目的蛋白質(zhì)上。然后用熒光激發(fā)CFP分子,。一旦目的蛋白質(zhì)在空間上接近(<20 nm)，CFP將作為供體并以光的形式發(fā)射能量轉(zhuǎn)移給作為受體的YFP,。研究人員將觀察到從CFP發(fā)出的藍色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)閺腨FP發(fā)出的黃色熒光,。使用BRET時，供體是生物發(fā)光分子（例如熒光素酶衍生物）,，與FRET一樣,，GFP衍生物作為受體。
圖1：擬南芥的共聚焦活細胞圖像,；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：GFP標記為綠色,，自發(fā)熒光葉綠體為紅色，透射光為藍色,?；谶@樣的圖像，可以完成FRET或FRAP等分析,。
FRAP–監(jiān)測蛋白質(zhì)和囊泡轉(zhuǎn)運
光漂白后熒光恢復(fù)(FRAP)是一種常用的監(jiān)測蛋白質(zhì)或囊泡轉(zhuǎn)運的方法,。熒光蛋白（通常是GFP）附著在目的蛋白質(zhì)上（即要監(jiān)測此蛋白質(zhì)的運動）,。通常情況下，整個細胞最初發(fā)出熒光,，因為整個細胞中可能含有豐富的蛋白質(zhì),。然后細胞的某個區(qū)域，通常是神經(jīng)元細胞中的細胞突起,，如軸突或樹突,，暴露在高強度的光下（通常是激光），該特定區(qū)域的熒光被破壞（漂白）,。隨著目的蛋白質(zhì)的移動,，來自細胞其他區(qū)域的蛋白質(zhì)會以一定的速度重新侵入漂白區(qū)域，然后漂白區(qū)域的熒光恢復(fù),。這能讓研究人員深入了解胞內(nèi)運輸動力學,。
TIRF–觀察靠近細胞膜的生物進程
TIRF（全內(nèi)反射）顯微鏡是一種特殊技術(shù)，用于觀察位于或靠近細胞質(zhì)膜的事件,。TIRF顯微鏡使用僅穿透細胞60-250 nm的瞬逝場進行熒光染料激發(fā),，可提供出色的z分辨率，從而能對質(zhì)膜中或附近發(fā)生的事件進行成像（例如分子運輸至質(zhì)膜）,，而不會被細胞內(nèi)分子發(fā)出的熒光所掩蓋,。
TIRF圖像：靠近膜的Galectin-3（半乳糖凝集素3）囊泡沿肌動蛋白絲的運輸。
圖2A：落射熒光概覽圖像,，
圖2B：TIRF概覽圖像,，框選部分如C所示，
圖2C：TIRF截面的時間序列,；時間以秒為單位,。靠近膜（箭頭）的Galectin-3囊泡（用YFP標記）首先沿著肌動蛋白絲（從底部向上）運輸,，轉(zhuǎn)移到另一條肌動蛋白絲（88秒）,，向左移動（109秒），再向右運輸,，再次轉(zhuǎn)換肌動蛋白絲,，然后向上運輸（246秒）。
YFP：紅色,；CFP：綠色,；概覽圖像的標尺：20 µm；截面：6 µm,；TIRF穿透深度：110 nm,。由德國馬爾堡大學的Ralf Jacob提供
光活化——監(jiān)測基因表達和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運
最近開發(fā)的一種被稱為光活化的方法能夠選擇性地標記細胞或整個生物體內(nèi)的特定區(qū)域或感興趣區(qū)域。進行光活化時,，使用專門設(shè)計的染料或熒光蛋白,，如光活化綠色熒光蛋白(paGFP)或Kaede,。這些熒光團在正常狀態(tài)下不發(fā)熒光。但在用特定波長的光照射后,，它們可以像傳統(tǒng)熒光團一樣被激活,，發(fā)出熒光。在很多情況下,，將這些蛋白質(zhì)與某些目的蛋白質(zhì)進行基因融合,，可以監(jiān)測其表達或轉(zhuǎn)運。然后可以應(yīng)用FRAP或粒子跟蹤等方法來進一步研究目的蛋白質(zhì),。
MPE–深入研究進程
在細胞培養(yǎng)實驗中,，現(xiàn)代生物學研究需要真正的體內(nèi)研究來補充“類似體內(nèi)"研究。但很難研究像老鼠這樣的生物體內(nèi)發(fā)生的過程,。多光子激發(fā)(MPE)顯微鏡能夠更深入地穿透組織,，因為與用于單光子激發(fā)的短波長光相比，近紅外激發(fā)光具有更長的波長,，散射更少,。MPE技術(shù)的非線性特性將光漂白和光毒性限制在焦點區(qū)域。這對長期研究非常有益,，因為熒光蛋白和生物體都受到這些問題的困擾,。據(jù)報告，使用合適的標本和顯微鏡設(shè)置,，成像深度可以深入組織中數(shù)毫米,。激發(fā)的精確定位使其也適用于光子操縱。該方法在神經(jīng)生物學中得到了廣泛的應(yīng)用,。
STED——納米級的細胞動力學研究
受激發(fā)射損耗(STED)顯微鏡使科學家能夠研究超出光學分辨率極限的結(jié)構(gòu),。該技術(shù)利用熒光染料的特性，受激發(fā)射,，以消除可檢測的信號,。目前已成功成像50-70 nm的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。提高分辨率對于研究小的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)非常重要,。尤其是對于想研究共定位事件的人來說,，提高分辨率可以產(chǎn)生更真實的結(jié)果,。與其他超分辨率技術(shù)相比,，STED的隨機獨立性能夠?qū)崿F(xiàn)極為快速的成像。已實現(xiàn)視頻速率STED采集,，可以實時研究細胞動力學,。
圖3：使用snap-tag技術(shù)的STED活細胞成像：Vero細胞，結(jié)構(gòu)：EB3,，瞬時轉(zhuǎn)染,；標簽：Oregon Green 488,。
FLIM–活細胞的空間測量
熒光壽命成像的優(yōu)點是數(shù)據(jù)不依賴于信號強度。因此不受光漂白和濃度變化等常見偽影的影響,。使用時間相關(guān)的單光子計數(shù),，通過單分子檢測數(shù)據(jù)重建FLIM圖像?？梢杂涗浐头治鰜喖{秒熒光壽命的最小變化,。該方法可用于研究導(dǎo)致熒光壽命改變的任何類型的細胞外和細胞內(nèi)環(huán)境改變?；贔LIM的FRET分析對發(fā)射強度不敏感,，從而提高了定量數(shù)據(jù)的精度。
CARS和SRS – 使用振動對比的無標記方法
幾乎所有的活細胞熒光成像方法都基于熒光蛋白的基因表達,。這涉及到大量的技術(shù)工作和高昂的費用,。此外，外部基因的表達可能會改變微環(huán)境,，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)與實際生理學情況的差異,。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微鏡和受激拉曼散射(SRS)顯微鏡是不依賴于熒光染料的非線性共聚焦方法。這些無標記方法可對樣品中特定化學鍵的振動狀態(tài)進行成像,。生物體中特定化學鍵的積累,，例如軸突周圍髓鞘中的脂質(zhì)，可以在無需染色的情況下以高分辨率和出色的信噪比質(zhì)量進行成像,。
未來屬于定量分析
生物學研究已經(jīng)脫離了描述性研究的時代,，進入了定量分析的時代。新的活細胞成像技術(shù)在空間和時間上都朝著分辨率更高的方向發(fā)展,。目前的技術(shù)發(fā)展主要是在納米范圍內(nèi)對單個分子和短至幾皮秒的分子反應(yīng)進行定量研究,。
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