冠狀病毒2致重度急性呼吸綜合征(SARS-CoV-2)
冠狀病毒2致重度急性呼吸綜合征(SARS-CoV-2)出現(xiàn)于2019年末，并快速傳播,。由于其大面積的影響,，研究人員對病毒的性質(zhì)進行了深入的研究以期最終阻止大流行。一個重要的方面是病毒如何在宿主細胞中復(fù)制,。Ogando及其同事的研究已經(jīng)揭示了SARS-CoV-2的復(fù)制動力學(xué),、適應(yīng)能力和細胞病理學(xué)。他們的工具之一是用熒光顯微鏡觀察SARS-CoV-2感染的VeroE6細胞,。通過使用前一段時間產(chǎn)生的抗SARS-CoV（2002）的抗體,，他們發(fā)現(xiàn)了與SARS-CoV-2的強烈交叉反應(yīng)。因此,，他們建立了一種通過免疫熒光顯微成像研究SARS-CoV-2復(fù)制的工具,。
用于病毒復(fù)制研究的
正置熒光顯微鏡THUNDER-DM6B
病毒可以借助幾種顯微鏡技術(shù)進行研究。根據(jù)顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率,，可以在組織水平,、細胞水平或病毒粒子水平進行觀察（圖1）。通常,，病毒粒子本身只能通過電子顯微鏡或超分辨顯微鏡來分辨,。在細胞水平上，病毒大多借助先進的寬場熒光或共焦顯微鏡進行觀察,。在組織中,，明場顯微鏡或基本的寬場熒光顯微鏡足以用于病毒研究。但是顯微技術(shù)的鑒別并不是嚴(yán)格的,。
徠卡的THUNDER實時成像（WO2019 /185174 A1）可以幫助提高背景信噪比,，減少離焦模糊。相關(guān)的對比度增強可以揭示顯微圖像中的附加信息,。
圖1: 病毒可從組織到單個病毒顆粒的不同層面進行觀察,。對于這種方法，需要明顯的放大倍數(shù)和分辨率。因此,，研究人員選擇了一種適合他們需要的顯微鏡技術(shù),。
病毒蛋白的免疫熒光檢查
在測序技術(shù)、生物信息學(xué)和電子顯微鏡中,，Ogando等人通過熒光顯微鏡分析了感染細胞：VeroE6細胞生長在玻璃蓋玻片上,，感染SARS-CoV-2，并用多聚甲醛固定,。然后,，用事先暴露于SARS-CoV的兔子或小鼠的抗血清孵育細胞（圖2）。用熒光標(biāo)示的二級抗體檢測與VeroE6細胞SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)結(jié)合的SARS-CoV源性抗體,。此外,，細胞核用Hoechst染色。用DM6 B正置熒光顯微鏡進行熒光成像,。
圖2: Ogando等人的一項實驗涉及使用免疫熒光顯微鏡對VeroE6細胞成像,。在2002/2003年SARS爆發(fā)期間，他們大體上探索了在兔子身上制備抗SARS-CoV抗血清的潛力,。他們使用不同的兔抗血清作為第一組抗體,。然后，用第二組熒光抗體標(biāo)記這些兔抗血清,。隨后,，用DM6 B顯微鏡進行熒光顯微鏡檢查。
SARS-CoV抗血清與SARS-CoV-2的交叉反應(yīng)
免疫熒光顯微鏡顯示,，許多SARS-CoV抗血清在SARS-CoV-2感染細胞（病毒蛋白nsp3,、nsp4、nsp5,、nsp8,、nsp9、nsp13,、nsp15,、N、M）中具有交叉反應(yīng)性,。這一事實意味著,，針對SARS-CoV產(chǎn)生的抗血清也導(dǎo)致SARS-CoV-2感染細胞的特征性熒光染色（圖3）。nsps出現(xiàn)在感染細胞的核周區(qū),，而N蛋白則分布在胞漿中,。在高爾基體中檢測到M蛋白。
圖3: SARS-CoV-2感染VeroE6細胞后用兔SARS-CoV抗血清處理的免疫熒光圖像,。Nsps位于細胞核附近,，M蛋白位于高爾基體,。抗dsRNA抗體用于標(biāo)記病毒RNA合成的復(fù)制中間產(chǎn)物,。細胞核用Hoechst染色,。（a）和（b）的比例尺為25 μm；（c）,、（d）和（e）的比例尺為100 μm,。圖片來源：Ogando et al., Journal of General Virology (DOI 10.1099/jgv.0.001453)。
正置熒光顯微鏡在病毒學(xué)研究中的潛力
Ogando等人的研究中描述的交叉反應(yīng)抗血清將是特征性SARS-CoV-2復(fù)制周期的實用工具,。這個工具反過來能使研究人員能夠確定復(fù)制抑制劑的潛在目標(biāo),。
一個相對簡單的實驗裝置-免疫熒光顯微鏡-足以得出病毒復(fù)制周期的結(jié)論。因為在這種方法中細胞生長在蓋玻片上,，并安裝在玻片上，所以正置熒光顯微鏡是一種實用的解決方案,。配備有電動載物臺和采用寬視野（FOV）的自動化掃片模塊幫助用戶快速獲取全玻片的圖像概覽,。如果單視野快拍就能滿足需求，則機械式載物臺是更合理的選擇,。
THUNDER DM6B能一次進行8玻片的全玻片自動掃描
圖為THUNDER DM6B實時自動掃描的小鼠視網(wǎng)膜組織,。
（左側(cè)為普通DM6B的寬場熒光成像，右側(cè)為THUNDER DM6B的熒光成像）
全景大圖無縫拼接
無需任何軟件后處理
實時掃描,，即拍即有
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