冠狀病毒2致重度急性呼吸綜合征(SARS-CoV-2)
冠狀病毒2致重度急性呼吸綜合征(SARS-CoV-2)出現(xiàn)于2019年末，并快速傳播,。由于其大面積的影響,，研究人員對(duì)病毒的性質(zhì)進(jìn)行了深入的研究以期最終阻止大流行。一個(gè)重要的方面是病毒如何在宿主細(xì)胞中復(fù)制,。Ogando及其同事的研究已經(jīng)揭示了SARS-CoV-2的復(fù)制動(dòng)力學(xué),、適應(yīng)能力和細(xì)胞病理學(xué)。他們的工具之一是用熒光顯微鏡觀察SARS-CoV-2感染的VeroE6細(xì)胞,。通過(guò)使用前一段時(shí)間產(chǎn)生的抗SARS-CoV（2002）的抗體,，他們發(fā)現(xiàn)了與SARS-CoV-2的強(qiáng)烈交叉反應(yīng)。因此,，他們建立了一種通過(guò)免疫熒光顯微成像研究SARS-CoV-2復(fù)制的工具,。
用于病毒復(fù)制研究的
正置熒光顯微鏡THUNDER-DM6B
病毒可以借助幾種顯微鏡技術(shù)進(jìn)行研究。根據(jù)顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率,，可以在組織水平,、細(xì)胞水平或病毒粒子水平進(jìn)行觀察（圖1）。通常,，病毒粒子本身只能通過(guò)電子顯微鏡或超分辨顯微鏡來(lái)分辨,。在細(xì)胞水平上，病毒大多借助先進(jìn)的寬場(chǎng)熒光或共焦顯微鏡進(jìn)行觀察,。在組織中,，明場(chǎng)顯微鏡或基本的寬場(chǎng)熒光顯微鏡足以用于病毒研究。但是顯微技術(shù)的鑒別并不是嚴(yán)格的,。
徠卡的THUNDER實(shí)時(shí)成像（WO2019 /185174 A1）可以幫助提高背景信噪比,，減少離焦模糊。相關(guān)的對(duì)比度增強(qiáng)可以揭示顯微圖像中的附加信息,。
圖1: 病毒可從組織到單個(gè)病毒顆粒的不同層面進(jìn)行觀察,。對(duì)于這種方法,，需要明顯的放大倍數(shù)和分辨率。因此,，研究人員選擇了一種適合他們需要的顯微鏡技術(shù),。
病毒蛋白的免疫熒光檢查
在測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)和電子顯微鏡中,，Ogando等人通過(guò)熒光顯微鏡分析了感染細(xì)胞：VeroE6細(xì)胞生長(zhǎng)在玻璃蓋玻片上,，感染SARS-CoV-2，并用多聚甲醛固定,。然后,，用事先暴露于SARS-CoV的兔子或小鼠的抗血清孵育細(xì)胞（圖2）。用熒光標(biāo)示的二級(jí)抗體檢測(cè)與VeroE6細(xì)胞SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)結(jié)合的SARS-CoV源性抗體,。此外,，細(xì)胞核用Hoechst染色。用DM6 B正置熒光顯微鏡進(jìn)行熒光成像,。
圖2: Ogando等人的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)涉及使用免疫熒光顯微鏡對(duì)VeroE6細(xì)胞成像,。在2002/2003年SARS爆發(fā)期間，他們大體上探索了在兔子身上制備抗SARS-CoV抗血清的潛力,。他們使用不同的兔抗血清作為第一組抗體,。然后，用第二組熒光抗體標(biāo)記這些兔抗血清,。隨后,，用DM6 B顯微鏡進(jìn)行熒光顯微鏡檢查。
SARS-CoV抗血清與SARS-CoV-2的交叉反應(yīng)
免疫熒光顯微鏡顯示,，許多SARS-CoV抗血清在SARS-CoV-2感染細(xì)胞（病毒蛋白nsp3,、nsp4、nsp5,、nsp8,、nsp9、nsp13,、nsp15,、N、M）中具有交叉反應(yīng)性,。這一事實(shí)意味著,，針對(duì)SARS-CoV產(chǎn)生的抗血清也導(dǎo)致SARS-CoV-2感染細(xì)胞的特征性熒光染色（圖3）。nsps出現(xiàn)在感染細(xì)胞的核周區(qū),，而N蛋白則分布在胞漿中,。在高爾基體中檢測(cè)到M蛋白。
圖3: SARS-CoV-2感染VeroE6細(xì)胞后用兔SARS-CoV抗血清處理的免疫熒光圖像,。Nsps位于細(xì)胞核附近,，M蛋白位于高爾基體,。抗dsRNA抗體用于標(biāo)記病毒RNA合成的復(fù)制中間產(chǎn)物,。細(xì)胞核用Hoechst染色,。（a）和（b）的比例尺為25 μm；（c）,、（d）和（e）的比例尺為100 μm。圖片來(lái)源：Ogando et al., Journal of General Virology (DOI 10.1099/jgv.0.001453),。
正置熒光顯微鏡在病毒學(xué)研究中的潛力
Ogando等人的研究中描述的交叉反應(yīng)抗血清將是特征性SARS-CoV-2復(fù)制周期的實(shí)用工具,。這個(gè)工具反過(guò)來(lái)能使研究人員能夠確定復(fù)制抑制劑的潛在目標(biāo)。
一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)裝置-免疫熒光顯微鏡-足以得出病毒復(fù)制周期的結(jié)論,。因?yàn)樵谶@種方法中細(xì)胞生長(zhǎng)在蓋玻片上,，并安裝在玻片上，所以正置熒光顯微鏡是一種實(shí)用的解決方案,。配備有電動(dòng)載物臺(tái)和采用寬視野（FOV）的自動(dòng)化掃片模塊幫助用戶快速獲取全玻片的圖像概覽,。如果單視野快拍就能滿足需求，則機(jī)械式載物臺(tái)是更合理的選擇,。
THUNDER DM6B能一次進(jìn)行8玻片的全玻片自動(dòng)掃描
圖為THUNDER DM6B實(shí)時(shí)自動(dòng)掃描的小鼠視網(wǎng)膜組織,。
（左側(cè)為普通DM6B的寬場(chǎng)熒光成像，右側(cè)為THUNDER DM6B的熒光成像）
全景大圖無(wú)縫拼接
無(wú)需任何軟件后處理
實(shí)時(shí)掃描,，即拍即有
了解更多：徠卡顯微
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