買回來之后，發(fā)現(xiàn)這兩個熒光標記信號果然很強,，穩(wěn)定性也比之前的FITC,、TRITC好多了，543nm的激光器激發(fā)Alexa 568雖然效率不是很高,，但是把激光器能量打滿,，檢測器的增益調(diào)高一點，信號還是很OK的,?？勺鯢RET AB的時候,，卻發(fā)現(xiàn)本應發(fā)生FRET效應的兩個標記在漂白了Alexa 568之后，Alexa 488的信號并沒有增強,，當時也是百思不得其解,，再咨詢了其他有FRET經(jīng)驗的老師，他們說,，有時候二抗的空間構(gòu)象也會影響FRET的效果,，而且FRET AB的實驗結(jié)果確實也不太穩(wěn)定，重復性也不高,，好在當時通過其他的實驗方法驗證了我們研究的兩個蛋白確實有相互作用,，這個數(shù)據(jù)不放進去也能夠說明問題，也就沒有過多的深究了,。
畢業(yè)之后,，進入了徠卡當了一名技術(shù)支持，接觸的東西多了,，才發(fā)現(xiàn)隨著熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和不同熒光染料的開發(fā),，在做熒光成像的時候，有太多熒光標記可以選擇了,，但很多客戶受限于購買共聚焦顯微鏡時選擇的有限的幾根激光譜線,，導致有很多熒光標記無法使用，使得有時候在寬場熒光顯微鏡上能夠使用的染料在共聚焦上反倒效果不好了,。
當時經(jīng)典的激光光源通常僅提供單一的窄帶發(fā)射,。有些氣體激光器可以同時發(fā)射幾種光線，最常見的例子就是氬離子激光器,，在藍綠范圍內(nèi)可以提供5條譜線（458,、476、488,、496,、514 nm）。有些固體激光器雖然可以調(diào)節(jié)波長,，但僅適用紅外波段（例如用于雙光子成像的Ti:Sa激光器）,，除了高度精密和極其昂貴之外，它們同一時間僅能發(fā)射單一波長的光線,，而且調(diào)節(jié)波長的過程非常緩慢（需要好幾秒）。
到了2008年,，徠卡基于其強大的研發(fā)能力和厚實的專有技術(shù)基礎,，推出了第一款配備超連續(xù)光譜激光器的共聚焦顯微鏡TCS SP5X，可以選擇470-670nm范圍內(nèi)任意波長作為激發(fā)譜線,，好家伙,，相當于一次性提供了足足201根激光器,。借助200納米的自由調(diào)節(jié)激發(fā)線，可以讓當時絕大多數(shù)的染料發(fā)揮出最佳激發(fā)性能,。這種靈活性對于需要為各種應用方向的用戶提供各種樣品和染料的成像平臺來說至關重要,。不僅如此，借助專有技術(shù)的AOBS聲光分光器,，能夠最多提供8條譜線同時激發(fā),。
在學習新產(chǎn)品的過程中，有一個案例讓我眼前一亮,，這不就是我的例子么,，要是當時遇見白激光這樣的神器，我也能成為案例里的“張三"了,。來自于Genoa的Caorsi V和Diaspro A當時也是拿Alexa 488和Alexa 568這樣一對供體-受體組合做FRET AB,，他們一開始也采用543nm的氦氖（HeNe）激光來漂白受體Alexa 488。根據(jù)公開的激發(fā)光譜數(shù)據(jù)顯示,，供體Alexa 488對于543nm激光的吸收率足夠低（不到2%）,，因此不會干擾受體漂白。這二位和我一樣,，實驗按照上述方法進行,，結(jié)果沒有檢測到供體信號增加，因此可以得出結(jié)論,，蛋白質(zhì)并非“共定位"且至少相隔10納米,。
然而不一樣的結(jié)局是，他們經(jīng)過測試,，發(fā)現(xiàn)在活體細胞中,，供體Alexa 488對543nm的吸收率大約為11%，也就是說,，用543nm漂白受體的時候,，供體也會被漂白。而使用580nm激光對該受體進行相同實驗,，供體發(fā)射增加了約三分之一,，F(xiàn)RET效率達到了32%。580nm距離供體激發(fā)足夠遠,，因此供體在受體漂白期間不會受到漂白,，并可在FRET受體漂白后發(fā)出更多熒光（圖一）?？梢?span style="color: rgb(237, 27, 47);">使用白激光靈活調(diào)節(jié)激發(fā)波長的特性,，能夠有效避開串色，從而獲得更精準的FRET結(jié)果,。
圖一 FRET AB測量,。FRET效率可以通過測量受體光漂白之后的供體發(fā)射增加獲得,。上圖：在使用傳統(tǒng)激光器時，供體發(fā)射沒有增加（左側(cè)的綠色圖片）,；下圖：受體采用白激光將波長調(diào)節(jié)到580nm漂白受體后,，供體熒光明顯增強（圖片來自：Caorsi V, Diaspro A, Genoa）
看到自家的產(chǎn)品解決了當年困擾自己的難題，既遺憾當初我怎么沒碰到這么好的機遇,，又慶幸技術(shù)的突破給眾多科學工作者帶來了解決問題的曙光,。
白激光除了精準激發(fā)、有效避免串色之外,，還有很多特性和應用,。敬請期待我們后續(xù)的推送吧。
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